[發(fā)明專利]一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選及鑒定檢測的方法

在審

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• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111518767A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設計）人: 易濱;梁曉飛;武田;汪新燕;劉林春
• 申請（專利權）人: 易濱;梁曉飛
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段宇

本發(fā)明提供了一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，取來自膽道腫瘤患者的外周血適量置于抗凝離心管中并混勻全血標本；對采集的血樣依次進行去除血漿蛋白及血漿核酸、去除紅細胞、分層離心、去除白細胞的樣品處理；采用HSPG抗體或SDC1亞型抗體或SDC2亞型抗體或GPC1亞型抗體或GPC3亞型抗體結合免疫磁珠捕獲HSPG陽性或SDC1陽性或SDC2陽性或GPC1陽性或GPC3陽性的CTC。本發(fā)明將HSPG作為膽囊癌以及膽管癌相對特異的CTC分選的功能性腫瘤分子標記，從而提高膽道腫瘤CTC的分選效率，建立一套基于HSPG的CTC分子分型評分體系，獲得用于膽道腫瘤高特異度、高敏感度的檢測方法，基于高效分選的膽道腫瘤CTC進行下游RNA?seq、基因NGS檢測，獲得腫瘤特異性分子信息用于提高特異度。

技術領域

本發(fā)明涉及生物與醫(yī)學檢測技術領域，尤其涉及到一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選及鑒定檢測的方法。

背景技術

人外周血中的循環(huán)腫瘤細胞(Circulating Tumor Cell，CTC)是指從腫瘤病灶播散進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞，并在一定條件下可發(fā)展為腫瘤轉移性病灶。由于超過90％的癌癥死亡是由轉移造成的，而CTC是腫瘤轉移的直接來源，因此從血液中分離CTC并對其進行分子檢測越來越引起人們的重視。

目前CTC的檢測已從簡單的細胞計數(shù)，擴展到下游簇分析、分子分型、基因、轉錄和蛋白層面檢測的各個方向，在乳癌、結直腸癌、前列腺癌、肺癌已進入臨床實用，但在膽道癌的診治上仍有大量的空白。在精準醫(yī)學時代，血液標志物檢測因具有如下的特點及優(yōu)勢，對于腫瘤相關的基因突變檢測方法提供了新思路，1.取樣簡單，可提高隨訪率；2.可多次檢測隨訪觀察，可增加惡性腫瘤檢出率；3.無放射性及創(chuàng)傷性損害，可降低并發(fā)癥的發(fā)生率；4.可用于治療后的復發(fā)耐藥監(jiān)測，提高治療的效率。5.降低檢查成本，減輕政府和患者的經濟壓力，有很高的經濟效益比。

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycan，HSPG)是由硫酸乙酰肝素鏈結合在核心蛋白上的一組糖蛋白，在細胞表面和細胞外基質中均有分布，基質HSPG主要與細胞浸潤和遷徙有關；胞膜HSPG主要包括Syndecan和Glypican，功能涉及：作為生長因子的共同受體調節(jié)信號轉導，與粘附分子共同調節(jié)細胞遷移，結合調節(jié)胞外基質金屬蛋白酶活性等。在腫瘤發(fā)生與進展時，HSPG的含量、組分和功能出現(xiàn)異常，膜HSPG可與多種生長因子(如FGF、PDGF、EGF、HGF、IGF等)結合，激活相關通路。HSPG總體表達在膽道癌中少有研究，我們已獲得的結果包括：對527例膽囊癌組織標本的研究發(fā)現(xiàn)，總HSPG主要表達于膽囊癌細胞表面，總HSPG表達陽性率為77.0％(406/527)。在低分化腺癌中HSPG含量升高，細胞分化程度低、伴有局部轉移、臨床分期晚期的GBC組織中HSPG硫酸化水平升高，硫酸化HSPG陽性患者化療反應性更差，生存期更短。

循環(huán)腫瘤細胞與組織相比，可以實現(xiàn)無創(chuàng)檢測，而與血漿中游離的大分子相比，又具有無可比擬的穩(wěn)定性，因此，具有很大的優(yōu)勢和潛力。本發(fā)明將HSPG作為膽囊癌以及膽管癌相對特異的CTC分選的功能性腫瘤分子標記，從而提高膽道腫瘤CTC的分選效率，建立一套基于HSPG的CTC分子分型評分體系，獲得用于膽道腫瘤高特異度、高敏感度的檢測方法，基于高效分選的膽道腫瘤CTC進行下游RNA-seq、基因NGS檢測，獲得腫瘤特異性分子信息用于提高特異度。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選及鑒定檢測的方法，將HSPG作為膽囊癌以及膽管癌相對特異的CTC分選的功能性腫瘤分子標記，從而提高膽道腫瘤CTC的分選效率，建立一套基于HSPG的CTC分子分型評分體系，獲得用于膽道腫瘤高特異度、高敏感度的檢測方法，基于高效分選的膽道腫瘤CTC進行下游RNA-seq、基因NGS檢測，獲得腫瘤特異性分子信息用于提高特異度。

本發(fā)明采用的技術方案如下：一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，包括如下步驟：