[發(fā)明專利]一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選及鑒定檢測的方法

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• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111518767A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 易濱;梁曉飛;武田;汪新燕;劉林春
• 申請（專利權(quán)）人: 易濱;梁曉飛
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段宇

1.一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)取樣：取來自膽道腫瘤患者的外周血適量置于抗凝離心管中并混勻全血標本；

(2)對步驟(1)中采集的血樣依次進行去除血漿蛋白及血漿核酸、去除紅細胞、分層離心、去除白細胞的樣品處理；

(3)洗滌磁微粒：吸取適量免疫磁微粒混懸液至于EP管中，靜置后吸棄溶液，加入緩沖液混勻，靜置后棄上清液，重復(fù)3次后用緩沖液重懸磁微粒至原體積；

(4)抗體孵育：將一定量的免疫磁微粒緩慢加入步驟(2)中處理好的樣本中顛倒混勻，調(diào)節(jié)搖床搖速，并將離心管傾斜固定于搖床上，室溫搖動30min，每10min混勻一次；

(5)富集CTC：將步驟(4)中的處理好的樣品轉(zhuǎn)移至新的離心管中，將離心管靠于磁力架上靜置，此時捕獲CTC的磁珠會吸附在磁力架的一側(cè)，倒置一下磁力架和離心管，實現(xiàn)清洗離心管蓋上的樣本；

(6)靜置10min后，吸棄澄清液，隨后加入適量的dd H₂O清洗磁球；

(7)加入CF1固定液進行涂片，并在37℃的條件下烘干；

(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，然后在裝有2×SSC緩沖液的37℃的水浴鍋中預(yù)熱10min；

(9)分別選用75％、85％和無水乙醇進行脫水，分別進行2min，并在室溫下風干；

(10)加入10μL熒光探針并封片，隨后置于雜交儀中在76℃下雜交10min，并在37℃下雜交1.5h；

(11)用鑷子撕去封片膠，放入43℃的甲酰胺中，脫落蓋玻片，浸洗10min，然后再采用2×SSC緩沖液浸洗15min，且每5min搖晃一次；

(12)在樣本區(qū)涂100μL的CK熒光抗體染色液，并在37℃的濕盒避光條件下孵育1h；

(13)洗棄CK熒光抗體染色液，用0.2％BSA洗兩次后，加10μLDAPI蓋片讀片。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：所述步驟(2)中血樣處理過程的去除血漿蛋白及血漿核酸、去除紅細胞、分層離心、去除白細胞過程具體為：

S1：去除血漿蛋白及血漿核酸，將采集的血樣加入緩沖液，離心去除上清液，隨后輕搖離心管，混勻沉淀細胞；

S2：去除紅細胞：混勻沉淀細胞后，加入裂解液，將抗凝離心管置于垂直混勻儀混勻，離心棄上清液，輕搖抗凝離心管，混勻沉淀細胞后補加緩沖液；

S3：分層離心：于新的抗凝離心管中加入分層液，將S2中的抗凝離心管中的物質(zhì)疊加到該分層液上層，然后用緩沖液清洗S2中的抗凝離心管管壁，并將清洗液同時轉(zhuǎn)移至分層液頂層，隨后進行離心處理；

S4：去除白細胞：S3中的抗凝離心管離心處理后可見三層溶液，輕柔的吸取最上的2層溶液于新的離心管內(nèi)，并加入緩沖液，顛倒混勻后離心棄上清液，隨后加入緩沖液，混勻沉淀細胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：所述步驟(3)中的免疫磁微粒為已結(jié)合HSPG抗體、SDC1亞型抗體、SDC2亞型抗體、GPC1亞型抗體、GPC3亞型抗體中的一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：所述已結(jié)合HSPG抗體的免疫磁微粒由如下成分組成：氧化鐵納米顆粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、HSPG。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：所述已結(jié)合SDC1亞型抗體的免疫磁微粒由如下成分組成：氧化鐵納米顆粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC1。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：所述已結(jié)合SDC2亞型抗體的免疫磁微粒由如下成分組成：氧化鐵納米顆粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC2。