[發(fā)明專利]一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選及鑒定檢測(cè)的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010162771.6
• 申請(qǐng)日: 2020-03-10
• 公開（公告）號(hào): CN111518767A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 易濱;梁曉飛;武田;汪新燕;劉林春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 易濱;梁曉飛
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段宇

1.一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)取樣：取來自膽道腫瘤患者的外周血適量置于抗凝離心管中并混勻全血標(biāo)本；

(2)對(duì)步驟(1)中采集的血樣依次進(jìn)行去除血漿蛋白及血漿核酸、去除紅細(xì)胞、分層離心、去除白細(xì)胞的樣品處理；

(3)洗滌磁微粒：吸取適量免疫磁微粒混懸液至于EP管中，靜置后吸棄溶液，加入緩沖液混勻，靜置后棄上清液，重復(fù)3次后用緩沖液重懸磁微粒至原體積；

(4)抗體孵育：將一定量的免疫磁微粒緩慢加入步驟(2)中處理好的樣本中顛倒混勻，調(diào)節(jié)搖床搖速，并將離心管傾斜固定于搖床上，室溫?fù)u動(dòng)30min，每10min混勻一次；

(5)富集CTC：將步驟(4)中的處理好的樣品轉(zhuǎn)移至新的離心管中，將離心管靠于磁力架上靜置，此時(shí)捕獲CTC的磁珠會(huì)吸附在磁力架的一側(cè)，倒置一下磁力架和離心管，實(shí)現(xiàn)清洗離心管蓋上的樣本；

(6)靜置10min后，吸棄澄清液，隨后加入適量的dd H₂O清洗磁球；

(7)加入CF1固定液進(jìn)行涂片，并在37℃的條件下烘干；

(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，然后在裝有2×SSC緩沖液的37℃的水浴鍋中預(yù)熱10min；

(9)分別選用75％、85％和無水乙醇進(jìn)行脫水，分別進(jìn)行2min，并在室溫下風(fēng)干；

(10)加入10μL熒光探針并封片，隨后置于雜交儀中在76℃下雜交10min，并在37℃下雜交1.5h；

(11)用鑷子撕去封片膠，放入43℃的甲酰胺中，脫落蓋玻片，浸洗10min，然后再采用2×SSC緩沖液浸洗15min，且每5min搖晃一次；

(12)在樣本區(qū)涂100μL的CK熒光抗體染色液，并在37℃的濕盒避光條件下孵育1h；

(13)洗棄CK熒光抗體染色液，用0.2％BSA洗兩次后，加10μLDAPI蓋片讀片。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：所述步驟(2)中血樣處理過程的去除血漿蛋白及血漿核酸、去除紅細(xì)胞、分層離心、去除白細(xì)胞過程具體為：

S1：去除血漿蛋白及血漿核酸，將采集的血樣加入緩沖液，離心去除上清液，隨后輕搖離心管，混勻沉淀細(xì)胞；

S2：去除紅細(xì)胞：混勻沉淀細(xì)胞后，加入裂解液，將抗凝離心管置于垂直混勻儀混勻，離心棄上清液，輕搖抗凝離心管，混勻沉淀細(xì)胞后補(bǔ)加緩沖液；

S3：分層離心：于新的抗凝離心管中加入分層液，將S2中的抗凝離心管中的物質(zhì)疊加到該分層液上層，然后用緩沖液清洗S2中的抗凝離心管管壁，并將清洗液同時(shí)轉(zhuǎn)移至分層液頂層，隨后進(jìn)行離心處理；

S4：去除白細(xì)胞：S3中的抗凝離心管離心處理后可見三層溶液，輕柔的吸取最上的2層溶液于新的離心管內(nèi)，并加入緩沖液，顛倒混勻后離心棄上清液，隨后加入緩沖液，混勻沉淀細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：所述步驟(3)中的免疫磁微粒為已結(jié)合HSPG抗體、SDC1亞型抗體、SDC2亞型抗體、GPC1亞型抗體、GPC3亞型抗體中的一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：所述已結(jié)合HSPG抗體的免疫磁微粒由如下成分組成：氧化鐵納米顆粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、HSPG。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：所述已結(jié)合SDC1亞型抗體的免疫磁微粒由如下成分組成：氧化鐵納米顆粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC1。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法，其特征在于：所述已結(jié)合SDC2亞型抗體的免疫磁微粒由如下成分組成：氧化鐵納米顆粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC2。