[發(fā)明專利]一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選及鑒定檢測(cè)的方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202010162771.6 | 申請(qǐng)日: | 2020-03-10 |
| 公開(公告)號(hào): | CN111518767A | 公開(公告)日: | 2020-08-11 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 易濱;梁曉飛;武田;汪新燕;劉林春 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 易濱;梁曉飛 |
| 主分類號(hào): | C12N5/09 | 分類號(hào): | C12N5/09;C12Q1/6858 |
| 代理公司: | 北京卓特專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11572 | 代理人: | 段宇 |
| 地址: | 200000 *** | 國(guó)省代碼: | 上海;31 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 膽道 腫瘤 血清 ctc 特異性 分選 鑒定 檢測(cè) 方法 | ||
1.一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法,其特征在于:包括如下步驟:
(1)取樣:取來自膽道腫瘤患者的外周血適量置于抗凝離心管中并混勻全血標(biāo)本;
(2)對(duì)步驟(1)中采集的血樣依次進(jìn)行去除血漿蛋白及血漿核酸、去除紅細(xì)胞、分層離心、去除白細(xì)胞的樣品處理;
(3)洗滌磁微粒:吸取適量免疫磁微粒混懸液至于EP管中,靜置后吸棄溶液,加入緩沖液混勻,靜置后棄上清液,重復(fù)3次后用緩沖液重懸磁微粒至原體積;
(4)抗體孵育:將一定量的免疫磁微粒緩慢加入步驟(2)中處理好的樣本中顛倒混勻,調(diào)節(jié)搖床搖速,并將離心管傾斜固定于搖床上,室溫?fù)u動(dòng)30min,每10min混勻一次;
(5)富集CTC:將步驟(4)中的處理好的樣品轉(zhuǎn)移至新的離心管中,將離心管靠于磁力架上靜置,此時(shí)捕獲CTC的磁珠會(huì)吸附在磁力架的一側(cè),倒置一下磁力架和離心管,實(shí)現(xiàn)清洗離心管蓋上的樣本;
(6)靜置10min后,吸棄澄清液,隨后加入適量的dd H2O清洗磁球;
(7)加入CF1固定液進(jìn)行涂片,并在37℃的條件下烘干;
(8)滴加4%多聚甲醛固定8min,然后在裝有2×SSC緩沖液的37℃的水浴鍋中預(yù)熱10min;
(9)分別選用75%、85%和無水乙醇進(jìn)行脫水,分別進(jìn)行2min,并在室溫下風(fēng)干;
(10)加入10μL熒光探針并封片,隨后置于雜交儀中在76℃下雜交10min,并在37℃下雜交1.5h;
(11)用鑷子撕去封片膠,放入43℃的甲酰胺中,脫落蓋玻片,浸洗10min,然后再采用2×SSC緩沖液浸洗15min,且每5min搖晃一次;
(12)在樣本區(qū)涂100μL的CK熒光抗體染色液,并在37℃的濕盒避光條件下孵育1h;
(13)洗棄CK熒光抗體染色液,用0.2%BSA洗兩次后,加10μLDAPI蓋片讀片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法,其特征在于:所述步驟(2)中血樣處理過程的去除血漿蛋白及血漿核酸、去除紅細(xì)胞、分層離心、去除白細(xì)胞過程具體為:
S1:去除血漿蛋白及血漿核酸,將采集的血樣加入緩沖液,離心去除上清液,隨后輕搖離心管,混勻沉淀細(xì)胞;
S2:去除紅細(xì)胞:混勻沉淀細(xì)胞后,加入裂解液,將抗凝離心管置于垂直混勻儀混勻,離心棄上清液,輕搖抗凝離心管,混勻沉淀細(xì)胞后補(bǔ)加緩沖液;
S3:分層離心:于新的抗凝離心管中加入分層液,將S2中的抗凝離心管中的物質(zhì)疊加到該分層液上層,然后用緩沖液清洗S2中的抗凝離心管管壁,并將清洗液同時(shí)轉(zhuǎn)移至分層液頂層,隨后進(jìn)行離心處理;
S4:去除白細(xì)胞:S3中的抗凝離心管離心處理后可見三層溶液,輕柔的吸取最上的2層溶液于新的離心管內(nèi),并加入緩沖液,顛倒混勻后離心棄上清液,隨后加入緩沖液,混勻沉淀細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法,其特征在于:所述步驟(3)中的免疫磁微粒為已結(jié)合HSPG抗體、SDC1亞型抗體、SDC2亞型抗體、GPC1亞型抗體、GPC3亞型抗體中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法,其特征在于:所述已結(jié)合HSPG抗體的免疫磁微粒由如下成分組成:氧化鐵納米顆粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、HSPG。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法,其特征在于:所述已結(jié)合SDC1亞型抗體的免疫磁微粒由如下成分組成:氧化鐵納米顆粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC1。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種膽道腫瘤血清中CTC特異性分選的方法,其特征在于:所述已結(jié)合SDC2亞型抗體的免疫磁微粒由如下成分組成:氧化鐵納米顆粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、SDC2。
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