[發明專利]檢測樹鼩LCN2基因轉錄水平的引物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010162520.8
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111187846A
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: 王陳蕓;唐東紅;葉尤松;李哲麗;李濤;徐瑾;董鑫;張銘娟;黃明峰
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 于洪;陳左

1.檢測樹鼩LCN2基因轉錄水平的引物，其特征在于，包括樹鼩LCN2基因表達水平的特異性上、下游引物和作為內參基因的樹鼩GAPDH基因的特異性上、下游引物；

其中，樹鼩LCN2基因表達水平的特異性上、下游引物序列如下：

LCN2 F：5＇-ggaagtggtacaccgtaggc-3＇；

LCN2 R：5＇-gtagctgccgtcttcgttca-3＇；

作為內參基因的樹鼩GAPDH基因的特異性上、下游引物序列如下：

GAPDH F：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；

GAPDH R：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。

2.含有權利要求1所述檢測樹鼩LCN2基因轉錄水平的引物的試劑盒。

3.權利要求1所述的引物、權利要求2所述的試劑盒在非診斷目的檢測樹鼩LCN2基因轉錄水平的應用。

4.用于非診斷目的檢測樹鼩LCN2基因轉錄水平的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1），分別以健康和待測樹鼩新鮮腎臟組織提取的總RNA為模板，逆轉錄合成得樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈；

步驟（2），建立樹鼩GAPDH基因及LCN2基因標準曲線：以Easy dilution梯度稀釋步驟（1）得到的健康樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈，分別以未稀釋cDNA第一鏈及稀釋后的cDNA為模板，進行實時熒光定量檢測，并分別以LCN2 F和LCN2 R、GAPDH F和GAPDH R為特異性引物，進行實時熒光定量PCR擴增，分別得到健康樹鼩LCN2基因、GAPDH基因的溶解曲線和擴增曲線；

之后以起始模板量拷貝數Log₁₀的對數值為X軸，以Cq值為Y軸進行繪制，分別得到GAPDH基因、LCN2基因的標準曲線；

步驟（3），將步驟（1）得到的待測樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈分別以LCN2 F和LCN2 R、GAPDH F和GAPDH R為特異性引物，進行實時熒光定量PCR擴增，擴增體系和擴增程序與步驟（2）相同，分別得到待測樹鼩LCN2基因、GAPDH基因的溶解曲線和擴增曲線；

之后根據步驟（2）得到的標準曲線進行計算，得到樹鼩LCN2基因轉錄水平。

5.根據權利要求4所述的用于非診斷目的檢測樹鼩LCN2基因轉錄水平的方法，其特征在于，以Easy dilution梯度稀釋樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈，梯度稀釋倍數分別為5倍、25倍、125倍、625倍。

6.根據權利要求4所述的用于非診斷目的檢測樹鼩LCN2基因轉錄水平的方法，其特征在于：

實時熒光定量PCR擴增體系下：SYBR Premix Ex Taq II (2x) 5μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板0.8μL，去離子水3.4μL，總計10μL，上、下游引物濃度均為10μM。

7.根據權利要求4所述的用于非診斷目的檢測樹鼩LCN2基因轉錄水平的方法，其特征在于：

實時熒光定量PCR擴增程序為：95℃預變性30s，95℃變性10s、60℃退火30s、40個循環。