[發(fā)明專利]巴氏綜合癥可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞及其制備方法和分化培養(yǎng)基和用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010161853.9
• 申請(qǐng)日: 2020-03-10
• 公開（公告）號(hào): CN111454885A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 褚茂平;郭曉令
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院;溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077;C12N5/074;C12N7/01
• 代理公司: 溫州名創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33258
• 代理人: 陳加利

本發(fā)明公開了巴氏綜合癥可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞及其制備方法和分化培養(yǎng)基和用途，取巴氏綜合癥患者的150?200毫升尿液，通過2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘獲取尿液細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后以3.5?4×10⁵數(shù)量接種到基質(zhì)膠37℃孵育1個(gè)小時(shí)以上的6孔培養(yǎng)板中。傳代后培養(yǎng)第三代尿液細(xì)胞達(dá)到80％匯合后，感染含OCT4、SOX2、KLF4和c?MYC四種轉(zhuǎn)錄因子的仙臺(tái)病毒進(jìn)行重編程誘導(dǎo)。病毒感染15天后開始出現(xiàn)克隆團(tuán)樣細(xì)胞，通過手工挑選克隆團(tuán)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的基質(zhì)膠孵育過的24孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)。通過多次傳代，完成多項(xiàng)指標(biāo)鑒定后，從而獲得純化的巴氏綜合癥患者尿液細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞系(TAZ?UiPSC)。該TAZ?UiPSC可以被定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞來建立體外細(xì)胞模型，用于巴氏綜合癥發(fā)病機(jī)理的研究和靶向藥物的篩選。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是指巴氏綜合癥可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞及其制備方法和分化培養(yǎng)基和用途。

背景技術(shù)

在1983年,巴斯綜合征(BTHS)被彼得·巴斯博士首次發(fā)現(xiàn)，并被廣泛認(rèn)為是一種罕見的與X染色體連鎖的常染色體隱性遺傳病。該病包含骨骼肌病，心肌病，生長(zhǎng)遲緩和3-甲基戊烯二酸尿癥等，發(fā)病率僅為1/300000-400000。巴斯綜合征的臨床特征包括肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、左室不致密、室性心律失常、心內(nèi)膜纖維彈性變性、近端肌病、心源性猝死、中性粒細(xì)胞減少、嗜睡和疲勞、低血糖、乳酸中毒、進(jìn)食困難等。

在1996年，巴斯綜合征的潛在突變被定位到Xq28染色體上的tafazzin(TAZ)基因上，主要包括TAZ基因的刪除突變(c.517delG)和錯(cuò)義突變(c.328TC)。TAZ基因主要參與心肌細(xì)胞中心磷脂(CL)的生物合成，該過程主要分布于線粒體膜中，心肌細(xì)胞中心磷脂(CL)可與呼吸鏈、線粒體代謝物載體、塑造線粒體形態(tài)蛋白等多種重要蛋白復(fù)合物直接相互作用發(fā)揮功能。

由于人的心肌細(xì)胞很難獲取，難度大成本高。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題和不足，本發(fā)明的目的是提供一種巴氏綜合癥可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞及其制備方法和分化培養(yǎng)基和用途，從而獲得可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的更多來源和更多應(yīng)用價(jià)值。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種巴氏綜合癥可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞制備方法，包括以下步驟：

S1:取巴氏綜合癥患者的150-200毫升尿液，通過離心方式分離獲取尿液細(xì)胞；

S2:細(xì)胞計(jì)數(shù)后以3.5-4×10⁵數(shù)量接種到基質(zhì)膠37℃孵育1個(gè)小時(shí)以上的6孔培養(yǎng)板中，傳代后培養(yǎng)第三代尿液細(xì)胞達(dá)到80％匯合，采用EDTA胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代；

S3:將經(jīng)步驟S2培養(yǎng)的尿液細(xì)胞感染含OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四種轉(zhuǎn)錄因子的仙臺(tái)病毒進(jìn)行重編程誘導(dǎo)，病毒感染15天后開始出現(xiàn)克隆團(tuán)細(xì)胞；

S4:挑選出擴(kuò)增培養(yǎng)的克隆團(tuán)細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)移到新的基質(zhì)膠孵育過的24孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)，用僅第一天含有10微摩爾Y-27623的E8培養(yǎng)基按每天換液方式繼續(xù)培養(yǎng)，5-7天后克隆團(tuán)達(dá)到90％匯合；

S5:采用0.5毫摩爾EDTA消化后按1：6-1：10的比率進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過多次傳代，從而獲得純化的巴氏綜合癥患者尿液細(xì)胞來源的可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的細(xì)胞系。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是還提供一種巴氏綜合癥可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞制備所用的重編程誘導(dǎo)的病毒，該病毒為感染含OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四種轉(zhuǎn)錄因子的仙臺(tái)病毒。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是一種如巴氏綜合癥可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞，記為TAZ-UiPSC。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種基于所述的巴氏綜合癥可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞在分化培養(yǎng)心肌細(xì)胞的應(yīng)用，將所述的巴氏綜合癥可誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞在培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行多個(gè)階段分化，獲得心肌細(xì)胞。