[發明專利]巴氏綜合癥可誘導多功能干細胞及其制備方法和分化培養基和用途

在審

• 申請號: 202010161853.9
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111454885A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 褚茂平;郭曉令
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學附屬第二醫院;溫州醫科大學附屬育英兒童醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/074;C12N7/01
• 代理公司: 溫州名創知識產權代理有限公司 33258
• 代理人: 陳加利

1.一種巴氏綜合癥可誘導多功能干細胞制備方法，其特征在于包括以下步驟：：

S1:取巴氏綜合癥患者的150-200毫升尿液，通過離心方式分離獲取尿液細胞；

S2:細胞計數后以3.5-4×10⁵數量接種到基質膠37℃孵育1個小時以上的6孔培養板中，傳代后培養第三代尿液細胞達到80％匯合，采用EDTA胰蛋白酶進行消化傳代；

S3:將經步驟S2培養的尿液細胞感染含OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四種轉錄因子的仙臺病毒進行重編程誘導，病毒感染15天后開始出現克隆團細胞；

S4:挑選出擴增培養的克隆團細胞，并將其轉移到新的基質膠孵育過的24孔培養板上培養，用僅第一天含有10微摩爾Y-27623的E8培養基按每天換液方式繼續培養，5-7天后克隆團達到90％匯合；

S5:采用0.5毫摩爾EDTA消化后按1：6-1：10的比率進行傳代培養，通過多次傳代，從而獲得純化的巴氏綜合癥患者尿液細胞來源的可誘導多功能干細胞的細胞系。

2.一種巴氏綜合癥可誘導多功能干細胞制備所用的重編程誘導的病毒，其特征在于：該病毒為感染含OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四種轉錄因子的仙臺病毒。

3.一種如權利要求1所述制備方法所制備的巴氏綜合癥可誘導多功能干細胞。

4.一種基于權利要求3所述的巴氏綜合癥可誘導多功能干細胞在分化培養心肌細胞的應用，其特征在于：將所述的巴氏綜合癥可誘導多功能干細胞在培養基培養后進行多個階段分化，獲得心肌細胞。

5.根據權利要求2所述的巴氏綜合癥可誘導多功能干細胞在分化培養心肌細胞的應用，其特征在于包括以下步驟：

(1)將所述的巴氏綜合癥可誘導多功能干細胞接種到基質膠孵育，然后通過E8培養基按每天換液方式進行培養2-3天；

(2)分化第一個階段，培養基換為含5微摩爾CHIR99021的RPMI+B27-Insulin分化培養基處理2天；

(3)分化第二個階段，培養基換為含5微摩爾IWR-1的RPMI+B27-Insulin分化培養基處理2天；

(4)分化第三個階段，培養基換為普通RPMI+B27-Insulin分化培養基處理2天；

(5)分化第四個階段，培養基換為普通RPMI+B27+Insulin分化培養基持續培養，然后每兩天換液一次。

6.一種如權利要求3所述的巴氏綜合癥可誘導多功能干細胞分化培養心肌細胞所用的分化培養基，其特征在于該分化培養基包括有：

用于分化第一階段的含5微摩爾CHIR99021的RPMI+B27-Insulin分化培養基；

用于分化第二個階段的含5微摩爾IWR-1的RPMI+B27-Insulin分化培養基；

用于分化第三個階段的RPMI+B27-Insulin分化培養基；

以及用于分化第四階段的RPMI+B27+Insulin分化培養基。