[發明專利]一種利用重組胞內RNA支架固定重組酶促進細胞催化阿洛醇生產的方法

有效

• 申請號: 202010160837.8
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111378612B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 林建強;柴玉穎;溫鑫;任一林;孫煦茵;宋欣;林建群
• 申請（專利權）人: 山東大學;青島龍鼎生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一種利用重組胞內RNA支架固定重組酶促進細胞催化阿洛醇生產的方法，步驟是：

（1）構建用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架；

合成一段如SEQ?ID?No.6所示的DNA序列，利用引物1和2將質粒pET22b線性化，根據同源重組構建重組質粒pET22b-scaffold；將同源重組液轉化到DH5α感受態細胞中，通過菌落PCR驗證獲得陽性轉化子，再提取重組質粒pET22b-scaffold，通過重組質粒轉化到大腸桿菌中實現支架的構建；其中，所述引物1和2如下：

引物1：5’CCCTATAGTGAGTCGTATTAACCTAATGCAGGTCCCGGAAGA3’，下劃線序列為與pET22b質粒重疊序列；

引物2：5’CCAATGGCGCGCCGAGCTTGGCGTAATgctcgccacttcgggctcatgagcg3’，下劃線序列為與pET22b質粒重疊序列；

（2）構建三角形網狀RNA支架錨定核糖醇脫氫酶（ribitol?dehydrogenase，RDH）和甲酸脫氫酶（formate?dehydrogenase，FDH）的重組質粒；

從Genebank基因庫中查詢獲得的核糖醇脫氫酶基因片段和甲酸脫氫酶基因片段，利用大腸桿菌密碼子偏好性進行密碼子優化，確定SEQ?ID?No.4所示的PP7的適配體序列和SEQID?No.5所示的BIV-TAT的適配體序列，將BIV-Tat標記FDH，將PP7標記RDH，利用引物5和6合成pp7-rdh和biv-tat-fdh基因，利用引物7，引物8通過PCR擴增得到核糖醇脫氫酶基因序列，利用引物9，引物10通過PCR擴增得到甲酸脫氫酶基因序列，同時利用引物3和4?將pACYCDuet1質粒進行線性化，并將線性化的pACYCDuet1質粒與合成得到的pp7-rdh/biv-tat-fdh基因進行同源重組，通過菌落PCR驗證獲得將目標基因亞克隆到質粒pACYCDuet1中的重組菌株，對獲得陽性轉化子提取質粒，所獲得的重組質粒命名為pACYCDuet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh；將此構建的重組質粒轉化到大腸桿菌BLStar細胞中，并通過IPTG誘導兩種酶融合體的表達，確認重組質粒的正確性；其中，所述涉及的引物序列如下：

引物3：5’ttaacctaggctgctgccac3’，下劃線序列為與pACYCDuet1質粒重疊序列；

引物4：5’TCCTGATCCTTTTTCGAACTGC3’，下劃線序列為與pACYCDuet1質粒重疊序列；

引物5：5’?cagcggtggcagcagcctaggttaattaCACGGCTTTTTTGAATTTTG3’?下劃線序列為與pACYCDuet1質粒重疊序列；

引物6：?5’AGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGGATCAGGAATGTCCAAAACCATCGTTCTTTCGGT3’下劃線序列為與pACYCDuet1質粒重疊序列；

引物7：5’GGATCAGGAGGAGGAGGATCAGGAGgaATGGCCATTAGCCTGGAAAATAAGG3’下劃線序列為與核糖醇脫氫酶基因重疊序列；

引物8：5’tttcgattatgcggccgtgtacaatacgaTTACAGATCAACACTATTCGGCAGAAT3’?下劃線序列為與核糖醇脫氫酶基因重疊序列；

引物9：5’GTcatcaccatcatcaccacGGATCAGGAATGGCAAAAGTGCTGTGCGTGCTGT3’下劃線序列為與甲酸脫氫酶基因重疊序列；

引物10：5’ttgctcagcggtggcagcagcctaggttaattaCACGGCTTTTTTGAATTTTG3’?下劃線序列為與甲酸脫氫酶基因重疊序列；

（3）構建利用三角形網狀RNA支架固定重組酶催化阿洛醇的大腸桿菌工程菌；

將重組質粒pACYCDuet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh及pET22b-scaffold共同轉化到大腸桿菌BLStar中構建工程菌株，并進行鑒定驗證即獲得利用三角形網狀RNA支架固定核糖醇脫氫酶和甲酸脫氫酶催化阿洛醇的大腸桿菌工程菌，該工程菌包含大腸桿菌BLStar的全基因組，重組質粒pET22b-scaffold和重組質粒pACYCDuet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh；

其中，上述三角形網狀RNA支架是由二維的三角形網狀RNA支架與SEQ?ID?No.4所示的PP7的適配體序列和SEQ?ID?No.5所示的BIV-TAT的適配體序列組成，該用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架的總核苷酸序列如SEQ?ID?No.6所示；其中所述二維的三角形網狀RNA支架是由以3',5'-磷酸二酯鍵連接SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.3所示單鏈RNA的核苷酸序列構成回文序列在細胞內形成三角形支架單元，該三角形支架單元中的每條SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.3所示單鏈RNA的核苷酸序列又分別與相鄰的三角形支架單元中與之完全相同的單鏈RNA的核苷酸序列根據堿基配對形成RNA雙鏈，并以此方式不斷配對形成RNA雙鏈，在細胞內構成了空間上呈二維的三角形網狀RNA支架；

（4）利用步驟（3）構建的大腸桿菌工程菌發酵生產阿洛醇；

活化步驟（3）構建的大腸桿菌工程菌菌種，按體積比1~2％的量將活化后的菌種接種到每100?mL的發酵培養基中，先以37?℃和200?rpm培養，培養3?h后，當培養菌液的OD為0.6~0.8時，加入IPTG至終濃度為1?mM，并將發酵條件改變為28?℃和140?rpm，繼續培養6~9h；然后將培養的菌液進行收菌，采用全細胞轉化法，將D-阿洛酮糖轉化為阿洛醇，通過標準曲線確定阿洛醇的產量并驗證大腸桿菌工程菌內已將核糖醇脫氫酶和甲酸脫氫酶錨定在RNA支架上；

所述發酵培養基的配方是：每100?mL的發酵培養基中，胰蛋白胨是1g、酵母提取物是0.5g、NaCl?是1g、葡萄糖是0.5g、氯霉素和氨芐青霉素的終濃度為100?μg/?mL、MgCl₂的濃度為20mM。