[發明專利]一種利用重組胞內RNA支架固定重組酶促進細胞催化阿洛醇生產的方法

有效

• 申請號: 202010160837.8
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111378612B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 林建強;柴玉穎;溫鑫;任一林;孫煦茵;宋欣;林建群
• 申請（專利權）人: 山東大學;青島龍鼎生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發明公開了一種利用重組胞內RNA支架固定重組酶促進細胞催化阿洛醇生產的方法，步驟包括(1)構建用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架；(2)構建三角形網狀RNA支架中錨定核糖醇脫氫酶和甲酸脫氫酶的重組質粒；(3)構建利用三角形網狀RNA支架固定重組酶催化阿洛醇的大腸桿菌工程菌；(4)利用步驟(3)構建的大腸桿菌工程菌發酵生產阿洛醇。本發明利用RNA支架錨定核糖醇脫氫酶和甲酸脫氫酶，縮短酶促反應的距離，高效促進了阿洛醇合成。實驗證實本發明方法構建的工程菌阿洛醇的產量能從3.036g/L提高到4.433g/L，有望在工業實際應用中，最大化地提高產物的產量。

技術領域

本發明涉及一種利用重組胞內RNA支架固定重組酶促進細胞催化阿洛醇(蒜糖醇)生產的方法。屬于生物化工領域。

背景技術

阿洛醇(蒜糖醇)是一種六碳的稀有糖醇，可在食品工業中用作無能量甜味劑或膨體劑，是治療糖尿病、癌癥和艾滋病的醫藥中間體，也是治療便秘的藥物。它還可以作為底物生產其他類型的D或L型稀有糖，如D/L-阿拉伯糖和D/L-阿洛糖。

阿洛醇在自然界中含量極低。因此，從自然資源中提取沒有經濟效益，并且會對環境造成嚴重破壞。化學合成阿洛醇工藝復雜，產率低，會產生有毒性的副產物。相比之下，生物轉化是生產阿洛醇的理想方法。

在細胞中，對于天然的多酶反應途徑，酶分子通常在物理和空間上組織成支架或簇或微腔。空間組織有助于底物在相互作用蛋白之間的流動，限制了不同中間代謝物之間的串擾，增加酶分子周圍底物的濃度，加速了反應過程。但是，對于大多數表達多酶催化反應的重組菌株，表達的酶分子會在細胞內隨機分布，造成不利影響。申請人研究發現在細胞內設置二維的三角形網狀RNA支架有助于使重組酶分子錨定到支架相鄰位置，克服上述不利影響，有望在發酵生產中得到應用。檢索顯示，有關利用重組胞內RNA支架固定重組酶促進細胞催化阿洛醇(蒜糖醇)生產的方法還未見報道。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種利用重組胞內RNA支架固定重組酶促進細胞催化阿洛醇(蒜糖醇)生產的方法。

本發明所述的利用重組胞內RNA支架固定重組酶促進細胞催化阿洛醇生產的方法，步驟是：

(1)構建用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架；

合成一段如SEQ?ID?No.6所示的DNA序列，利用引物1和2將質粒pET22b線性化，根據同源重組構建重組質粒pET22b-scaffold；將同源重組液轉化到DH5α感受態細胞中，通過菌落PCR驗證獲得陽性轉化子，再提取重組質粒pET22b-scaffold，通過重組質粒轉化到大腸桿菌中實現支架的構建；其中，所述引物1和2如下：

引物1：5’CCCTATAGTGAGTCGTATTAACCTAATGCAGGTCCCGGAAGA3’，下劃線序列為與pET22b質粒重疊序列；

引物2：5’CCAATGGCGCGCCGAGCTTGGCGTAATgctcgccacttcgggctcatgagcg3’，下劃線序列為與pET22b質粒重疊序列；

(2)構建三角形網狀RNA支架錨定核糖醇脫氫酶和甲酸脫氫酶的重組質粒；