[發明專利]一種獲取ADAR蛋白細胞內高效結合的底物序列的方法及底物序列和應用

有效

• 申請號: 202010158889.1
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111593093B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 張銳;楊文兵;宋玉龍
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/6809
• 分類號: C12Q1/6809
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

本發明公開了一種獲取ADAR蛋白細胞內高效結合的底物序列的方法及底物序列和應用。所述方法包括如下步驟：S1.細胞準備及蛋白與RNA交聯反應；S2.免疫共沉淀及雙鏈RNA消化，連接，和逆轉錄；S3.cDNA環化、建庫和高通量測序；S4.ADAR底物拼裝；S5.高效結合底物的評估。本發明首次開發了一種獲取ADAR蛋白細胞內高效結合的底物序列的方法irCLASH，本發明從實驗及生物信息學的角度填補現有ADAR1結合底物研究存在的空缺，與現有其他研究蛋白與RNA相互作用的方法相比，可顯著提高嵌合體讀長的得率，可最大限度提高了ADAR蛋白作用底物的構建數量，同時縮短實驗耗時、簡化了實驗操作。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體地，涉及蛋白質與RNA互作技術領域，更具體地，涉及一種獲取、定位ADAR蛋白在細胞內高效結合的底物序列信息的方法及底物序列，以用于定點靶向RNA編輯。

背景技術

基因突變是許多疾病及癌癥發生的關鍵誘因，目前已經有3000多個基因特定位點的突變與疾病的發生有關聯，隨著二代測序技術發展，不論是遺傳獲得性的基因突變還是后天生長發育過程中某些體細胞的基因突變都可以通過二代測序技術獲得突變位點信息，并且通過關聯分析找到與疾病發生直接相關的突變位點。但目前各種腫瘤在不同的人群中會有不同的突變位點及突變類型，這樣開發不同的靶向藥物具有一定的難度，而基因療法可直接對基因的突變位點進行修復。 CRISPR(Clustered regμLarly interspaced short palindromicrepeats)最早發現于細菌免疫系統中，結合cas蛋白抵抗外源病毒的入侵。目前CRISPR/Cas技術已經廣泛應用到生物醫學及農業學研究中。CRISPR/Cas技術可以在真核細胞基因組水平引入正確編碼的全長基因拷貝，也可以沉默產生突變的基因的表達、對突變位點進行定點修復。在2014年已經有第一例報道成功利用CRISPR技術對地中海貧血癥進行臨床治療。地中海貧血癥由HBB基因突變引起的血紅蛋白水平降低造成。該研究團隊將患者皮膚成纖維細胞誘導分化成多能干細胞并用 CRISPR/Cas9技術修復突變位點，并將修復后的干細胞誘導成紅細胞前體細胞并重新移植到患者體內達到治療目的。但CRISPR/Cas系統也有其不可避免的缺點，該系統需要同時表達Cas蛋白及導向RNA(gRNA)及提供同源修復DNA序列，且在多篇研究報道中都檢測出其在DNA水平或RNA水平有明顯的脫靶效應， CRISPR/Cas蛋白切割基因組DNA造成DSB(double-strand break)，脫靶會造成基因組的不穩定性以及不可預測的細胞命運。此外，CRISPR/Cas系統還可能會引發細胞固有免疫反應，例如，金黃色葡萄球菌來源的Cas9蛋白會誘導血液中的T細胞產生炎癥反應進而引起組織壞死。CRISPR/Cas系統的嚴重缺陷造成其臨床應用的局限性，故開發更加安全有效的基因療法是目前具有巨大臨床價值的研究。