[發明專利]一種獲取ADAR蛋白細胞內高效結合的底物序列的方法及底物序列和應用

有效

• 申請號: 202010158889.1
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111593093B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 張銳;楊文兵;宋玉龍
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/6809
• 分類號: C12Q1/6809
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

1.一種獲取ADAR蛋白細胞內高效結合的底物序列的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.在細胞中過表達ADAR蛋白，再交聯蛋白質和RNA；

S2.裂解細胞，免疫共沉淀蛋白與RNA交聯復合體，消化未被蛋白保護的RNA，用TSAP酶對消化后的RNA進行去磷酸化處理，接著用T4 PNK對RNA的5’末端做磷酸化修飾，進行RNA分子間連接，然后對連接后的RNA末端加接頭，純化120 kb～200 kb大小范圍的蛋白及RNA復合體并提取RNA后進行逆轉錄反應得cDNA；

S3.以步驟S2獲得的cDNA為模板做環化反應，純化后再線性化并進行兩輪PCR擴增，第二輪PCR時在擴增產物兩端分別接上測序文庫3'接頭和5'接頭，對構建好的文庫進行高通量測序；

S4.將高通量測序獲取的序列信息去接頭、質控、基因組對比，將讀長比對到轉錄組，丟棄比對上的讀長，保留未比對上的讀長并記錄為U1；把U1讀長比對到基因組并丟棄連續比對上的讀長，保留未比對上的讀長并記錄為U2；把U2讀長比對到基因組，把唯一且不連續的比對上的讀長記錄為嵌合體讀長并記錄為U3；把U3讀長比對到基因組上，并且根據比對結果對U3進行重新組合；把重組之后的讀長比對到基因組上，并提取嵌合體讀長；再對上述結果進行整合，獲得完整的嵌合體讀長集；再以嵌合體兩條臂讀長為中心取交集后再分別與非嵌合體讀長取交集，重組后的雙臂讀長再進行結構預測截取出雙鏈RNA底物序列，分別以左臂L和右臂R為標記注釋其序列信息組裝出ADAR蛋白的作用底物序列。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1為在細胞中過表達攜帶外源蛋白標簽的ADAR蛋白。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述外源蛋白標簽為3×FLAG標簽。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1所述交聯為紫外交聯。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2所述消化為利用RNA酶進行消化。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2所述接頭為iR800染料標記的接頭。

7.由權利要求1～6任一所述方法獲得的ADAR蛋白高效結合的底物，其特征在于，所述底物為雙鏈RNA底物，由左臂和右臂組成，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示。

8.權利要求1～6任一所述方法或權利要求7所述的ADAR蛋白高效結合的底物在非疾病診斷治療目的的定點靶向RNA編輯或在制備定點靶向RNA編輯產品中的應用。

9.權利要求1～6任一所述方法或權利要求7所述的ADAR蛋白高效結合的底物在制備RNA基因治療藥物中的應用。