[發明專利]一種人多能干細胞高效分化得到內皮祖細胞的方法

有效

• 申請號: 202010156258.6
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111440760B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 楊雋;秦克周;王雍;劉洪憲
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0735;C12N5/10
• 代理公司: 北京東巖躍揚知識產權代理事務所(普通合伙) 11559
• 代理人: 谷岳

本發明涉及一種人多能干細胞高效分化得到內皮細胞的方法，所述方法，包括以下：步驟1，人多能干細胞在含有Actin A，BMP4，Y27632的培養基中培養3天，分化為中胚層內皮前體細胞；步驟2，第4天更換為含有FGF2，VEGF，BMP4,SB431542的培養基，培養4天得到內皮祖細胞。

技術領域

本發明屬于生物制藥技術領域，具體而言，是提供一種高效、經濟的內皮細胞的培養方法，所得內皮祖細胞，可用于包括肺動脈高壓在內的心肺疾病的細胞治療及藥物篩選。

背景技術

肺動脈高壓(pulmonaryhypertension，PH)是一類預后不良、致殘及致死率高的疾病。 PH早期表現為肺血管阻力進行性增加，引起肺動脈壓力持續性升高，最終導致右心功能衰竭并死亡。肺動脈高壓是一種慢性持續性復雜疾病，涉及許多相關病變。歐洲和美國的流行病學調查顯示，特發性肺動脈高壓在女性中最常見，家族性肺動脈高壓與基因相關。

肺動脈高壓患者生存期較短，在未經治療的患者中，肺動脈高壓功能分級Ⅰ、Ⅱ級為6 年，Ⅲ級為2.5年，而Ⅳ級僅為6個月。若無有效的治療，肺動脈高壓患者的預后通常很差。這類患者的年死亡率約為15％。心肺功能不佳，活動能力低下，右心房壓力升高，右心室進行性衰竭，心輸出量低，腦鈉肽水平升高以及相關的結締組織疾病的進展都是預后不良的預兆。隨著我國醫學發展，肺動脈高壓已被認識為一類引起嚴重的社會問題的疾病狀態，不但給患者造成了嚴重的身心摧殘，同時也給家庭和社會增加了巨大的人力及財力負擔。因此，防治肺動脈高壓是延長壽命，保證人民生活質量的一個十分迫切的需求。

內皮功能障礙一直被認為是PH發生的主要原因。在缺氧環境中,內皮細胞(ECs)能夠調節血管張力并參與血管重塑和血管生成，內皮細胞包括生血內皮、血管內皮以及內皮祖細胞 (EPCs)。有文獻報道，與對照組相比，PAH患者外周血中CD133+細胞數量增加。Toshner等人也證實了遺傳性肺動脈高壓患者來源的EPCs中保護性的BMPII型受體表達水平降低。EPCs 已經被證實具有促進缺血組織血管新生的作用，因此EPCs能夠促進不同缺血性血管疾病的組織修復,如急性心肌梗死、不穩定心絞痛,中風,糖尿病微型血管病變,肺動脈高血壓,動脈粥樣硬化,和缺血性視網膜病變。與其他血細胞相比，EPCs在外周血或臍帶血中含量較少，擴增潛力有限，因此在臨床治療中，獲得大量有功能的EPCs進行血管修復是一個關鍵瓶頸。

人多能干細胞(human pluoripotent stem cells,hPSCs)包括胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)或誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)可以經過誘導分化產生內皮細胞。常用的一種方法是將細胞轉移到超低附著板中獲得擬胚體，隨后進一步產生各種類型的細胞。但是擬胚體的分化往往耗時較長，導致該方法的成本大，效率較低。相對而言，單層細胞分化方法則具有較高的效率，但仍需進一步改進，以更好地理解復雜的因素。

為滿足肺動脈高壓在內的心肺疾病的細胞治療及藥物篩選的需要，本發明優化內皮細胞的制備方法。本發明的方法是將人多能干細胞高效定向分化為：有功能的內皮祖細胞和生血內皮細胞的方法。

發明內容

本發明提供一種改進的人內皮細胞的分化方法，以獲得一種與健康供體分離的EPCs表型相匹配的人內皮祖細胞以供包括肺動脈高壓在內的心肺疾病的細胞治療及藥物篩選。

一種將人多能干細胞分化為內皮細胞的方法，其特征在于，所述方法，包括以下步驟：步驟1，人多能干細胞，在含有Actin A，Y27632，BMP4的培養基中培養3天，分化為中胚層內皮前體細胞；

步驟2，第4天更換為含有FGF2，VEGF，BMP4,SB431542的培養基，培養4天得到內皮祖細胞。