[發明專利]一種人多能干細胞高效分化得到內皮祖細胞的方法

有效

• 申請號: 202010156258.6
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111440760B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 楊雋;秦克周;王雍;劉洪憲
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0735;C12N5/10
• 代理公司: 北京東巖躍揚知識產權代理事務所(普通合伙) 11559
• 代理人: 谷岳

1.一種將人多能干細胞人工分化為內皮祖細胞的方法，其特征在于，當人類的iPSC增長到80％-90％，用Accutase對它們分離并以3×10⁴細胞/孔在玻連蛋白鋪底的12孔細胞培養板中進行培養，在補充有25ng/mL肌動蛋白A，10μM Y27632和10ng/mL骨形態發生蛋白4的E8培養基中培養3天，iPSC分化為中胚層內皮細胞；中胚層內皮細胞在補充有100ng/mlFGF2，50ng/mlVEGF，50ng/ml BMP4，5μM SB431542的E6培養基中培養4天，產生EPCs，整個分化過程持續7天；最后制備細胞懸液，進行細胞計數，并準備進行EPCs分離；使用CD31+微球進行EPCs磁珠分選，在含有16％胎牛血清的EGM2培養基中培養；iPSC-EPCs分別用含有終濃度10g/mL的DiI-Ac-LDL的無血清EBM-2培養基中孵育，檢測細胞對乙酰化低密度脂蛋白的攝取。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其中，人類的iPSC用E8培養基傳代培養，或用mTeSR^TM1完整或成分明確的CDM培養基傳代培養，其中，人類的iPSC在維持培養中用EDTA進行消化分離。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述Y27632化學結構式如下：

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過將10μM的Y27632溶于DMSO后，在分化前三天連續加入分化培養基，得到內皮祖細胞，用含有紅色熒光標記乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)的無血清EBM-2培養基孵育，通過檢測內皮細胞對乙酰化LDL的攝取鑒定內皮細胞功能。