[發明專利]一種液質聯用同時測定人血漿中替格瑞洛及其活性代謝物和內源性腺苷濃度的方法

有效

• 申請號: 202010155378.4
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111239303B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 王卓;張文靜;高麗紅;曹愛霖;許小建;仰先蜜;畢娟;楊云云;丁楠;鄧敏
• 申請（專利權）人: 上海長海醫院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 曹翠娟

1.一種液質聯用同時測定人血漿中替格瑞洛及其活性代謝物和內源性腺苷濃度的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）標準樣品制備：精密稱取替格瑞洛及其活性代謝物和腺苷，配制成腺苷濃度為110、55、11、5.5、3.3、2.2ng/mL；替格瑞洛濃度為1600、800、160、80、48、32 ng/mL；替格瑞洛活性代謝物濃度為1108、554、110.8、55.4、33.2、22.2 ng/mL的標準樣品，所有溶液在4℃下保存，備用；

（2）標準曲線血漿樣本的制備：取空白人正常血漿，先加入穩定劑：赤-9-（2-羥基-3-壬基）腺嘌呤, 雙密達膜, 外切-5'-核苷酸酶α-β-亞甲基ADP , 乙二胺四乙酸，然后分別加入步驟（1）制得的標準樣品，混勻，制成相應濃度的校正標樣；

（3）待測血漿樣本的制備：取全血樣本加入含有肝素抗凝劑的樣品管，立即加入穩定劑：赤-9-（2-羥基-3-壬基）腺嘌呤, 雙密達膜, 外切-5'-核苷酸酶α-β-亞甲基ADP , 乙二胺四乙酸，渦旋混勻，離心，分離血漿，得待測血漿樣本；

（4）血漿樣品預處理：取步驟（2）或（3）制得的血漿樣本先加入內標D⁷-替格瑞洛和15N-腺苷，然后加入用50%-70%乙腈溶解的30%高氯酸，渦旋后再加入緩沖液調節pH，離心處理后取上清液；

（5）標準曲線制作：將步驟（2）得到的校正標樣按照步驟（4）制備上清液樣品提取物進行液質聯用技術分析測定，分別以替格瑞洛及其活性代謝物和腺苷濃度為橫坐標，替格瑞洛及其活性代謝物和腺苷峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標，制作標準曲線；

（6）定量分析：取待測全血樣本，按照步驟（3）、（4）的方法處理后進行液質聯用技術分析測定，并按照步驟（5）所得的標準曲線方程計算，得到待測樣品中替格瑞洛及其活性代謝物和內源性腺苷的濃度；

所述活性代謝物為AR-C124910XX；

所述的方法，包括：A：同一質譜離子源下同時測定待測血漿樣品中替格瑞洛及其活性代謝物和內源性腺苷的濃度；B：同一色譜條件下同時測定待測樣品中替格瑞洛及其活性代謝物和內源性腺苷色譜峰；C：同一樣品預處理方法實現血漿樣品中替格瑞洛及其活性代謝物和內源性腺苷不同極性待測物的提取；

所述A的測定方法為：用質譜中ESI源正離子MRM多反應監測模式，用于定量分析的離子對分別為m/z 523.4→153.2替格瑞洛、m/z 479.4 →153.2替格瑞洛活性代謝物和m/z268.2 → 136.2腺苷；所述A的測定條件為：質譜條件為：噴霧電壓為5.5 kV，離子傳輸毛細管溫度為650℃；Gas1N₂壓力為90Arb,Gas2 N₂壓力為60Arb，簾氣N₂壓力為 28Arb；碰撞氣Ar 壓力為 Medium；DP電壓分別為38 eV腺苷、15eV¹⁵N-腺苷和70 eV替格瑞洛、替格瑞洛活性代謝物和D⁷-替格瑞洛；CE電壓分別為 25 eV腺苷、 15eV¹⁵N-腺苷和50 eV替格瑞洛、替格瑞洛活性代謝物和D⁷-替格瑞洛；CXP電壓分別為 2.3 eV; EP 電壓分別為4eV;正離子方式檢測；掃描方式為多反應監測 MRM；用于定量分析的離子對分別為： m/z 523.4→ 153.2替格瑞洛、m/z 479.4 → 153.2替格瑞洛活性代謝物、m/z 530.7→153.2D⁷-替格瑞洛, IS、m/z 268.2 →136.2腺苷和m/z 269.1→ 137.1¹⁵N-腺苷, IS；掃描時間為0.2 s；

所述B的測定方法為：用C₁₈分析柱和梯度洗脫，條件為：Zorbax SB-Aq C₁₈ column 250× 4.6 mmI.D.,5μm 色譜柱；流動相為甲醇-水含0.1%甲酸：0-4min：體積比5：95，4.1-10min：體積比80：20，10.1-20min：體積比5：95；流速為1 ml/min，柱溫為30℃。