[發明專利]一種從人多能干細胞分化為自然殺傷細胞的方法及應用

有效

• 申請號: 202010153358.3
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111235105B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 安徽中盛溯源生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/074;A01N1/02;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;田歡

本發明涉及干細胞生物學領域，具體涉及一種從人多能干細胞分化為自然殺傷細胞的方法及應用。本發明公開了一種多能干細胞來源的自然殺傷細胞，其表達CD56、Nkp30、Nkp44和Nkp46，還表達成熟自然殺傷細胞的標志物CD16和CD94。本發明還公開了一種制備自然殺傷細胞的方法，包括以下步驟：S1：形成擬胚體；S2：擬胚體向造血祖細胞分化；S3：造血祖細胞向NK細胞分化；S4：NK細胞的成熟和擴增。本發明提供的分化方法，基于成分明確的培養基和優化的細胞因子組合，能夠快速、高效、簡便且成本較低的誘導多能干細胞分化為自然殺傷細胞。

技術領域

本發明涉及干細胞生物學領域，尤其涉及多能或多潛能干細胞的譜系特異性分化，具體涉及一種從人多能干細胞分化為自然殺傷細胞的方法及應用。

背景技術

2018年全國最新癌癥報告顯示2014年全國惡性腫瘤估計新發病例數380.4萬例，平均每天超過1萬人被確診為癌癥。腫瘤發病率為278.07/10萬，0-74歲累積發病率為21.58％，累積死亡率為12.00％。2013年《科學》雜志將腫瘤免疫治療列為十大科學突破之首，免疫治療成為繼手術、化療、放療、腫瘤靶向治療后的新一代的腫瘤治療手段，為腫瘤病人的治療帶來了新的希望。

自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)是先天免疫系統的主力軍，是機體防御感染和抗擊腫瘤的第一道防線，可通過惡性病變細胞表面的“自我缺失”(missing-self)模式或“壓力誘導”(stress-induced)模式識別并殺傷病變細胞。NK細胞的激活依賴于其細胞表面的活化型和抑制型受體信號平衡的結果。活化的NK細胞可通過多種機制殺傷腫瘤細胞：NK細胞可釋放穿孔素和顆粒酶，直接作用于靶細胞以殺傷癌細胞；可通過分泌促炎性細胞因子促進癌細胞凋亡；可定向識別單克隆抗體藥物標記的癌細胞來完成殺傷。

NK細胞的識別和殺傷具有MHC-I非限制性、泛特異性和快速應答的特點，無移植物抗宿主反應(GVHD)，可采用異體細胞回輸，體內存活周期短，且無細胞因子風暴等副作用，可以與腫瘤靶向抗體聯合使用以增強抗癌效果，可以與基因編輯技術相結合開發出針對不同腫瘤靶點的靶向型的NK細胞產品，這些特點使其在腫瘤免疫治療中展現出巨大的應用潛力。

以往研究證實，腫瘤患者體內NK細胞通常數量減少、功能受損。因此NK細胞的過繼療法有恢復患者免疫功能以抵抗腫瘤的功效。但自體來源NK細胞回輸后的臨床研究結果顯示其抗腫瘤效果非常有限。主要原因可能包括：(1)自體NK細胞的KIR受體與腫瘤細胞HLA相匹配，“自我”識別信號抑制NK細胞活化；(2)患者自體NK細胞功能受損，難以產生理想的殺傷作用。

直接從外周血擴增的NK細胞有一定的難度，對患者的細胞可能出現擴增失敗，且通常擴增出的細胞混合物都含有一定比例的T細胞，需要做T細胞清除，否則會造成移植物抗宿主病(GVHD)。同時不同供體的NK細胞質量差異性很大，直接影響療效，難以形成標準化產品。

人多能干細胞(human pluripotent stem cell,hPSC)包括人胚胎干細胞(humanembryonic stem cell,hESC)和人誘導多能干細胞(human induced pluripotent stemcells，hiPSC)，具有無限增殖的能力，并且在體外可以分化為幾乎所有功能細胞，包括NK細胞。從人多能干細胞在體外規模化、標準化制備NK細胞是NK細胞產品成藥的有效的解決途徑。但目前已報道的分化過程，存在過程復雜、周期長、飼養層細胞依賴、培養基成分不明確、分化細胞功能缺陷、純度和活力低等問題，使其分化過程不利于規模化生產。

與本發明最接近的專利有：專利CN102388130A公開了一種多能細胞的分化，專利CN107429230A公開了一種用于誘導造血細胞分化的方法和組合物，專利CN102822332A公開了一種從源于hESC的成血管細胞產生自然殺傷細胞和樹突細胞的方法。