[發明專利]一種從人多能干細胞分化為自然殺傷細胞的方法及應用

有效

• 申請號: 202010153358.3
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111235105B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 安徽中盛溯源生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/074;A01N1/02;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;田歡

1.一種制備自然殺傷細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：形成擬胚體；

S2：擬胚體向造血祖細胞分化；

其中，所述S2包括：

S21：去除擬胚體上清液，加入新鮮的第一步驟分化培養基進行細胞培養；

其中，所述第一步驟分化培養基是在基礎分化培養基中添加小分子GSK3β抑制劑，以及至少一種以下成分：BMP信號通路激活劑、insulin、IGF-1、VEGF、bFGF；GSK3β抑制劑是CHIR99021，濃度為 0.5-20μM；BMP信號通路激活劑是BMP4，濃度為0-200 ng/mL；insulin、IGF-1、VEGF、bFGF的濃度分別為0-10μg/mL、0-100 ng/mL、5-100 ng/mL和0-100 ng/mL；

S22：去除第一步驟分化培養基，加入第二步驟分化培養基進行細胞培養；其中，所述第二步驟分化培養基是在基礎分化培養基中添加VEGF、bFGF，以及至少一種以下成分：BMP信號通路激活劑、Nodal抑制劑、insulin、IGF-1、IL3和IL6；其中，VEGF、bFGF 的濃度分別為5-100 ng/mL、0-100 ng/mL且非0； BMP信號通路激活劑是BMP4，濃度為 0-200 ng/mL；Nodal抑制劑是SB431542，濃度為 0-20μM；insulin、IGF-1、IL3和IL6的濃度分別為0-10μg/mL、0-100 ng/mL、0-20 ng/mL和 0-20 ng/mL；

S23：去除第二步驟分化培養基，加入第三步驟分化培養基進行細胞培養，得到造血祖細胞；其中，所述第三步驟分化培養基是在基礎分化培養基中添加生長因子和集落刺激因子；

所述生長因子選自insulin、VEGF、IGF-1和bFGF中的一種或多種，其中Insulin、VEGF、IGF-1和bFGF，濃度分別為 0.5-10μg/mL、5-100 ng/mL、0-100ng/mL和 0.5-100 ng/mL；所述集落刺激因子選自TPO、SCF和Flt-3L中的一種或多種；其中TPO、SCF和Flt-3L，濃度分別為 0-100ng/mL、0-100 ng/mL和 0-100ng/mL；

S3：造血祖細胞向NK細胞分化；

其中，在S3中，去除第三步驟分化培養基，將細胞接種于包被有基質蛋白的細胞培養容器，加入第四步驟分化培養基進行細胞培養；

所述基質蛋白至少包括Notch通路激活蛋白或整合蛋白中的一種；其中，所述第四步驟分化培養基是在基礎分化培養基中添加集落刺激因子和白細胞介素；集落刺激因子是TPO、SCF、Flt-3L和IL-3，濃度分別為0-100ng/mL、5-100ng/mL、5-100ng/mL和 5-100 ng/mL；白細胞介素是IL-2、IL-7和IL-15，濃度分別為100-1000 IU/mL、5-100 ng/mL和5-100ng/mL；

S4：NK細胞的成熟和擴增；

其中，所述S4包括：去除第四步驟分化培養基，加入第五步驟分化培養基進行細胞培養；其中，所述第五步驟分化培養基是在基礎分化培養基中添加白細胞介素和促進NK細胞成熟和擴增的物質；

所述白細胞介素選自IL-2、IL-12、IL-18、IL-21和IL-27和IL-15中的一種或者多種；所述促進NK細胞成熟和擴增的物質選自人AB血漿、人血小板裂解物、Vitamin A、煙酰胺、Vitamin E和Heparin中的一種或者多種；其中，IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27和IL-15的濃度分別為100-1000IU/mL、0-100 ng/mL、0-100 ng/mL、0-100 ng/mL、0-100ng/mL和5-100ng/mL；人血小板裂解物、煙酰胺（NAM）、Vitamin E和Heparin，濃度分別為1-10%、1-10mmol/L、0-10 mg/mL和0-100 μg/mL；

上述S2-S4基礎分化培養基包括IMDM 終濃度50%，F-12 終濃度50%，0.2-20mg/mlrHSA，0-1000 μM硫代甘油，0-200 μg/ml 抗壞血酸，1-50 μg/ml轉鐵蛋白，1-50 ng/ml亞硒酸鈉，5-100 μM 乙醇胺。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1包括：

S11：將人多能干細胞的細胞懸液置于搖床上搖動培養過夜，形成擬胚體。