[發明專利]表面展示型酵母宿主細胞及其在制備豬星狀病毒酵母疫苗的應用

在審

• 申請號: 202010153131.9
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111440816A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 張蕾;李婉情;張文濤;趙成雪
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/62;C07K19/00;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/865
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 琪琛

本發明公開了一種表面展示型酵母宿主細胞及其在制備豬星狀病毒酵母疫苗的應用。所述疫苗包含豬星狀病毒Cap蛋白的C?端高變區，利用釀酒酵母轉錄元件高效構建方法將GPD啟動子、Cap蛋白C?端高變區、凝集素Aga1以及純化標簽等串聯構建轉錄單位。本發明所述的疫苗可由葡萄糖誘導產生，生產成本較低，且適合大規模生產。實驗表明，本發明所述的釀酒酵母菌株具備使用的安全性，且能夠誘導顯著的黏膜免疫反應和體液免疫反應。

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，涉及一種表面展示型酵母宿主細胞及制備豬星狀病毒酵母疫苗的方法。

背景技術

酵母表面展示技術(Yeast surface display，YSD)是指外源蛋白或肽通過與細胞壁蛋白融合展示在酵母細胞表面的技術。1993年，Schreuder等人[1]首次對釀酒酵母細胞表面展示異源蛋白進行了描述。YSD最初用于生產生物催化劑，隨著分子生物學和酵母遺傳學的不斷發展，YSD已在各個領域得到廣泛應用。例如：生物吸附，生物修復和生物傳感器的設計。在生物醫學領域，例如抗體和口服疫苗的制備。在基礎科研領域，YSD被用于分析蛋白質-蛋白質及蛋白質-配體間的相互作用。α-凝集素系統是YSD中的一種由兩部分組成：Aga1亞基(錨定成分)，通過GPI插入細胞壁中；Aga2亞基(粘附成分)，用作靶肽或蛋白質的錨定蛋白。Aga2的Cys7和Cys50殘基通過兩個二硫鍵與Aga1結合。

生物遞送系統作為向黏膜表面遞送疫苗的最有效方式之一，目前用于生產疫苗抗原的遞送載體主要有五種：細菌，酵母，昆蟲，哺乳動物和植物表達系統。在這些遞送系統中，酵母因其獨有的優勢成為表達外源蛋白的優勢宿主。(1)釀酒酵母是一種公認的十分安全的真核模式生物，口服后不會產生任何有毒物質且無致病性。(2)釀酒酵母具有真核生物的優點，遺傳背景清晰，培養條件簡單，外源蛋白表達量高，是一種理想的外源蛋白表達宿主。(3)釀酒酵母具有真核生物翻譯后修飾過程，糖基化修飾后的病毒蛋白具有更好的免疫原性。(4)釀酒酵母已被用作口服疫苗和藥物示蹤跡，因為與其他載體相比，釀酒酵母堅固的細胞壁結構能夠保護生物大分子免受胃酸的消化分解。(5)釀酒酵母在腸道菌群產生的代謝物丁酸的輔助下，與小腸上皮細胞相互作用，刺激機體粘膜免疫系統。(6)釀酒酵母細胞壁成分β-1,3-葡聚糖和甘露聚糖具有強大的免疫佐劑活性，能增強機體的非特異性免疫應答反應。

星狀病毒是一種無囊膜的單股正鏈RNA病毒1975年Appleton和Higgins首次通過電子顯微鏡(Electron microscope，EM)在兒童腹瀉糞便中觀察到人星狀病毒[2,3]。此后，全世界很多國家和地區相繼出現了星狀病毒腸道感染的報道。星狀病毒可以感染哺乳動物(包括人類)和禽類動物等多種宿主，腹瀉是該病毒感染的特征性臨床表現[4,5]。人類星狀病毒感染與老年人和免疫功能缺陷患者的腹瀉和腸胃炎癥狀有密切關聯，并且被認為是引起嬰幼兒腹瀉的第二大病原體[6]。盡管其臨床意義重大，但由于該病毒(腹瀉癥狀)缺乏病毒穩定的傳代細胞系等原因，目前是研究最少的腸道RNA病毒之一[7]。

星狀病毒顆粒表面光滑，顆粒表面含有五個或六個星狀突起結構(約10％)。病毒顆粒呈正二十面體對稱，無囊膜包被，直徑28-41nm。Risco等人發現糞便中的病毒顆粒直徑為28-30nm，而LLC-MK2細胞中的病毒顆粒為41nm，有明顯的突起但無星狀結構[8]。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于Aga1-Aga2系統的表面展示型酵母宿主細胞及表達豬星狀病毒Cap蛋白的重組釀酒酵母表面展示疫苗株的制備方法。

本發明的技術方案包括：