[發(fā)明專利]表面展示型酵母宿主細(xì)胞及其在制備豬星狀病毒酵母疫苗的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010153131.9
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111440816A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張蕾;李婉情;張文濤;趙成雪
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/62;C07K19/00;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/865
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 琪琛

1.一種基于Aga1-Aga2釀酒酵母表面展示系統(tǒng)，其特征在于，包含來源酵母菌株EBY100的Agal基因以及來源PYD1質(zhì)粒的Aga2基因，所述Agal基因表達(dá)Agal亞基作為錨定成分，通過糖基磷脂酰肌醇插入細(xì)胞壁中，所述Aga2基因表達(dá)Aga2亞基作為粘附成分，用作靶肽或蛋白質(zhì)的錨定蛋白，通過錨定成分和粘附成分結(jié)合，靶肽或蛋白質(zhì)釀酒酵母表面展示。

2.一種載體，其包含權(quán)利要求1所述的Aga1片段，其堿基序列為SEQ ID No.15。

3.表面展示型酵母宿主細(xì)胞，其特征在于，含有權(quán)利要求1中所述的Aga1-Aga2釀酒酵母表面展示系統(tǒng)。

4.一種構(gòu)建表面展示型酵母宿主細(xì)胞的方法，其特征在于，以實驗室保存菌株JDY52為出發(fā)菌株，PCR克隆GPD啟動子，通過反向PCR擴增和無縫連接將PIU211 lac啟動子替換為GPD啟動子，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化將線性化質(zhì)粒PIU211(GPD)轉(zhuǎn)入JDY52，利用SD-URA選擇性培養(yǎng)基和基因組PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，獲得組成型葡萄糖啟動子GPD調(diào)控的、表面高效展示Aga1酵母宿主菌株ST1814G。

5.權(quán)利要求4所述的構(gòu)建表面展示型酵母宿主細(xì)胞的方法，其特征在于，具體包括如下步驟；

(1)PIU211重組質(zhì)粒構(gòu)建：提取EBY100酵母基因組，PCR擴增Aga1基因，通過無縫克隆將Aga1基因插入到整合型載體YIplac211；

(2)PIU211(GPD)重組質(zhì)粒構(gòu)建：遵循無縫克隆技術(shù)原理，設(shè)計一對反向擴增引物擴增PIU211(除lac啟動子外的其余部分)，然后以實驗室保存的HCKAN-GPD質(zhì)粒為模板擴增GPD啟動子，在GPD正/反向擴增引物5'末端引入載體的末端序列。通過無縫克隆將PIU211質(zhì)粒上lac啟動子替換為GPD啟動子；

(3)線性化載體的制備：重組質(zhì)粒PIU211(GPD)的外源插入基因Aga1序列中含有限制性內(nèi)切酶BsiWI的識別位點，用BsiWI消化PIU211或PIU211(GPD)可以獲取線性化DNA片段；

(4)表面高效展示Aga1釀酒酵母宿主菌的構(gòu)建：通過常規(guī)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將線性化PIU211或PIU211(GPD)片段轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株JDY52中，通過SD-URA營養(yǎng)缺陷篩選和PCR鑒定，獲得表面高效展示Aga1酵母宿主菌ST1814G。

6.豬星狀病毒融合蛋白Aga2-Cap，其核酸序列為SEQ ID No.12和SEQ ID No.17。

7.一種Cap蛋白表面展示釀酒酵母菌株，其特征在于，在ST1814G菌株中，包括權(quán)利要求6中所述的融合蛋白。

8.一種Cap蛋白表面展示釀酒酵母菌株，其特征在于，將源于PYD1質(zhì)粒的Aga2基因與含有豬星狀病毒的C端高變區(qū)基因串聯(lián)，構(gòu)建Aga2-Cap在酵母內(nèi)融合表達(dá)的轉(zhuǎn)錄單位，經(jīng)體外酶連、酵母體內(nèi)轉(zhuǎn)化及同源重組技術(shù)，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄單位并穩(wěn)定整合入基因組，通過Aga1-Aga2表面展示系統(tǒng)展示于酵母細(xì)胞表面，獲得表面展示Cap蛋白的重組酵母菌株。