[發(fā)明專利]鴨坦布蘇病毒膠體金快速檢測試紙及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010152368.5
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111190011A
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王學(xué)理;張玲艷;宋麗麗;賈偉娟
• 申請（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古民族大學(xué)
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 北京市商泰律師事務(wù)所 11255
• 代理人: 鄒芳德

一種家禽防疫用品及制作方法，即一種鴨坦布蘇病毒膠體金快速檢測試紙及其制備方法，所述試紙包括底板、樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維膜及吸水墊，樣品墊貼在PVC底板的一端，吸水墊貼于另一端，硝酸纖維膜貼于底板中部，硝酸纖維膜一端與膠體金墊相連，另一端與吸水墊連接，膠體金墊與樣品墊相連，E蛋白單克隆抗體用膠體金包被結(jié)合于膠體金墊上，鼠抗E蛋白多抗包被于硝酸纖維膜的劃線處作為檢測線，羊抗鼠IgG作為二抗包被于質(zhì)控線的位置。有益效果是：膠體金靈敏度高，試紙?zhí)禺愋詮?qiáng)，僅對坦布蘇病毒顯示陽性，可快速識別坦布蘇病毒，可對初期癥狀進(jìn)行鑒別，也可用于普通鴨群的篩查，可大幅縮短檢測時間，使該病及早發(fā)現(xiàn)，將養(yǎng)殖戶的損失降為最低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種家禽防疫用品及制作方法，即一種鴨坦布蘇病毒膠體金快速檢測試紙及其制備方法。

背景技術(shù)

鴨坦布蘇病毒（DTMUV）是一種鴨新型傳染性病毒。2010年我國山東江浙等沿海地區(qū)首次爆發(fā)，經(jīng)國家多個實(shí)驗室分析后將其命名。2016年內(nèi)蒙古東部地區(qū)出現(xiàn)類似病例，在內(nèi)蒙古民族大學(xué)動科實(shí)驗室進(jìn)行多項試驗后最終確定該病死鴨感染了鴨坦布蘇病毒。鴨坦布蘇病毒的主要感染癥狀為鴨產(chǎn)蛋率下降、生長遲緩及卵巢出血等。該病毒傳播速度快，感染率高，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)鴨業(yè)，急需得到有效的防治。可是，由于缺乏快速確診技術(shù)，該病毒的癥狀不易識別，難以早期控制，很容易造成蔓延。因此，找到快速識別的技術(shù)和器材，是防治該病毒的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能夠快速識別鴨坦布蘇病毒的膠體金快速檢測試紙及其制備方法。

上述目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：研制一種鴨坦布蘇病毒膠體金快速檢測試紙，其特點(diǎn)是：所述試紙包括底板、樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維膜及吸水墊，樣品墊粘貼在PVC底板的一端，吸水墊粘貼于底板的另一端，硝酸纖維膜粘貼于底板的中部，硝酸纖維膜一端與膠體金墊相連，膠體金墊與樣品墊相連，另一端與吸水墊連接，將E蛋白單克隆抗體作為金標(biāo)探針用膠體金進(jìn)行包被結(jié)合于膠體金墊上，再將鼠抗E蛋白多抗1:1稀釋包被于硝酸纖維膜的劃線處作為檢測線，羊抗鼠IgG做相同處理后作為二抗包被于質(zhì)控線的位置。

一種鴨坦布蘇病毒膠體金快速檢測試紙的制備方法：以DTMUV的囊膜蛋白E蛋白為核心蛋白，設(shè)計E蛋白引物，上游引物序列F為5^/-TTAGGATCCTTCAGCTGTCTGGGGATG-3^/（劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物序列R為5^/-TGAGAGCTCGGCATTGACATTTACTGC-3^/（劃線處為SacⅠ酶切位點(diǎn)），進(jìn)行E蛋白的克隆表達(dá)：所克隆基因片段大小為1500bp，表達(dá)蛋白大小為63ku；采用尿素梯度離心法對E蛋白進(jìn)行分離純化，純化蛋白的濃度為4.98mg/ml；用E蛋白（100ug）三次免疫BALB/c小鼠，之后用間接ELISA法篩選出血清效價高于1:5000的小鼠進(jìn)行四次免疫；提取上述小鼠脾細(xì)胞與SP2/O細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選出A1B3與B2C8兩株穩(wěn)定細(xì)胞；通過檸檬酸三鈉還原法制備大小為25nm的酒紅色膠體金溶液，膠體金溶液pH為8，將分離所得E蛋白單克隆抗體用透析袋處理法進(jìn)行除鹽，再用倍比稀釋法測得抗體最佳標(biāo)記濃度為1:8，將按上述條件優(yōu)化后的金標(biāo)探針包被于膠體金墊上，再將鼠抗E蛋白多抗1:1稀釋包被于硝酸纖維膜檢測線處，羊抗鼠IgG做相同處理后作為二抗包被于質(zhì)控線，之后將底板、膠體金墊、硝酸纖維膜、樣品墊、吸水墊進(jìn)行組裝，建成膠體金檢測試紙。