[發(fā)明專利]鴨坦布蘇病毒膠體金快速檢測試紙及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010152368.5
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111190011A
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王學(xué)理;張玲艷;宋麗麗;賈偉娟
• 申請（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古民族大學(xué)
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 北京市商泰律師事務(wù)所 11255
• 代理人: 鄒芳德

1.一種鴨坦布蘇病毒膠體金快速檢測試紙，其特征在于：所述試紙包括底板（1）、樣品墊（5）、膠體金墊（6）、硝酸纖維膜（2）及吸水墊（7），樣品墊（5）粘貼在PVC底板（1）的一端，吸水墊（7）粘貼于底板（1）的另一端，硝酸纖維膜（2）粘貼于底板（1）的中部，硝酸纖維膜（2）一端與膠體金墊（6）相連，膠體金墊（6）與樣品墊相連，另一端與吸水墊（7）連接，將E蛋白單克隆抗體作為金標(biāo)探針用膠體金進(jìn)行包被結(jié)合于膠體金墊（6）上，再將鼠抗E蛋白多抗1:1稀釋包被于硝酸纖維膜（2）的劃線處作為檢測線（3），羊抗鼠IgG做相同處理后作為二抗包被于質(zhì)控線（4）的位置。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鴨坦布蘇病毒膠體金快速檢測試紙的制備方法：其特征在于：以鴨坦布蘇病毒DTMUV的囊膜蛋白E蛋白為核心蛋白，設(shè)計E蛋白引物，上游引物序列F為5^/-TTAGGATCCTTCAGCTGTCTGGGGATG-3^/（劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物序列R為5^/-TGAGAGCTCGGCATTGACATTTACTGC-3^/（劃線處為SacⅠ酶切位點(diǎn)），進(jìn)行E蛋白的克隆表達(dá)：所克隆基因片段大小為1500bp，表達(dá)蛋白大小為63ku；采用尿素梯度離心法對E蛋白進(jìn)行分離純化，純化蛋白的濃度為4.98mg/ml；用E蛋白（100ug）三次免疫BALB/c小鼠，之后用間接ELISA法篩選出血清效價高于1:5000的小鼠進(jìn)行四次免疫；提取上述小鼠脾細(xì)胞與SP2/O細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選出A1B3與B2C8兩株穩(wěn)定細(xì)胞；通過檸檬酸三鈉還原法制備大小為25nm的酒紅色膠體金溶液，膠體金溶液pH為8，將分離所得E蛋白單克隆抗體用透析袋處理法進(jìn)行除鹽，再用倍比稀釋法測得抗體最佳標(biāo)記濃度為1:8，將按上述條件優(yōu)化后的金標(biāo)探針包被于膠體金墊上，再將鼠抗E蛋白多抗1:1稀釋包被于硝酸纖維膜檢測線處，羊抗鼠IgG做相同處理后作為二抗包被于質(zhì)控線，之后將底板、膠體金墊、硝酸纖維膜、樣品墊、吸水墊進(jìn)行組裝，建成膠體金檢測試紙。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述鴨坦布蘇病毒膠體金快速檢測試紙的使用方法，其特征在于：將檢測物置于樣品墊上，樣品在毛細(xì)作用下向前泳動，如樣品中含有目標(biāo)抗原，則會與膠體金墊上的特異性抗體結(jié)合形成復(fù)合物，之后該復(fù)合物繼續(xù)向前移動，當(dāng)復(fù)合物移至檢測線處時抗原又與檢測線上的抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，金標(biāo)抗體集聚于檢測線處顯示出紅色，剩余未能與檢測線上抗體結(jié)合的金標(biāo)抗體繼續(xù)向前泳動，當(dāng)其達(dá)到質(zhì)控線后與此處二抗進(jìn)行特異性結(jié)合并在此處集聚進(jìn)而顯現(xiàn)顏色；當(dāng)檢測線與質(zhì)控線均顯色時表明檢測物內(nèi)含有目標(biāo)抗原且該檢測試紙功能正常，檢測呈陽性；而當(dāng)僅質(zhì)控線顯色時則僅表明檢測試紙功能正常但檢測物內(nèi)無目標(biāo)抗原，呈陰性；檢測線顏色的深淺程度則表示目標(biāo)檢測物含量的多少。