[發明專利]一種新疆野蘋果抗病基因快速篩選鑒定的方法

在審

• 申請號: 202010150434.5
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111304238A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 張道遠;丁雨;文雪靜;劉曉潔;李小雙;楊紅蘭
• 申請（專利權）人: 中國科學院新疆生態與地理研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12Q1/18;C12Q1/6851
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所(普通合伙) 65106
• 代理人: 張莉

1.一種新疆野蘋果抗病基因快速篩選鑒定的方法，其特征在于該方法由目標基因瞬時遺傳轉化、腐爛病原菌接菌、抗病相關表型統計以及生理生化和分子相關檢測完成，具體操作按下列步驟進行：

目標基因瞬時遺傳轉化：

a、將目標基因的編碼區序列（CDS）構建到p1307載體上，形成35S:Flag-目標基因的重組載體，轉入農桿菌EHA105中，用轉化p1307-Flag空載的EHA105菌株為對照；

b、在YEP固體培養基上挑取單菌落，接種于10mL含有相應抗生素的YEP液體培養中，溫度28℃，200rpm振蕩培養過夜，得到菌液；

c、按1:250的體積比，將步驟b得到的菌液接種于200mL含有相應抗生素的YEP液體培養基中，溫度28℃，200rpm震蕩培養12個小時后，每隔1小時，用分光光度計檢測OD₆₀₀，直至菌液OD₆₀₀達到0.7-0.8之間，將菌液分裝于50mL離心管中，4000rpm，離心10min，收集菌體，棄上清液，加入瞬時侵染液，渦旋震蕩，懸浮菌體，其中侵染液配方：濃度為5% 的蔗糖，濃度為150μM AS，濃度為5 mM CaCl₂，濃度為0.015% DTT，濃度為20μM 5-AZA，濃度為0.01%Tween20；

d、以瞬時侵染液為空白對照調零，用分光光度計將懸浮菌體濃度調至OD₆₀₀=1.1-1.2；

e、選取長勢一致的4-5周苗齡野蘋果幼苗20株，浸泡在步驟c得到的懸浮菌體中，確保整株野蘋果苗完全沒入懸浮菌體中，90 rpm震蕩培養2-3h；

腐爛病原菌接菌：

f、在超凈臺取出步驟e得到的野蘋果苗植株，吸水紙吸干表面水分，用200μL槍頭在野蘋果苗植株葉片和莖尖制造傷口；

g、用200μL槍頭尾部在帶腐爛病菌的PDA培養基上培養7天，取直徑0.5cm菌餅貼于步驟f中的野蘋果苗植株葉片和莖尖傷口處，將貼好菌餅的野蘋果苗植株插入MS培養基中，培養2-5天，觀察表型；

抗病相關表型統計：

h、在第3-4天收樣，對野蘋果苗植株葉片和莖段拍照，用ImageJ和EXCEL軟件統計發病葉片比例，病斑面積，發病莖段比例，發病莖段長度數據，其中：

發病葉片比例=葉片發病個數/葉片總個數×100%；

發病葉片病斑面積比例=發病葉片的總面積/總葉片的面積×100%

發病莖段比例=莖段發病個數/莖段總個數×100%

發病莖段病斑長度比例=莖段發病總長度/總的莖段長度×100%；

i、將莖段用濃度3%次氯酸鈉表面消毒10分鐘，截斷至1cm長度，置于PDA固體培養基上，溫度25℃，培養1-5天，觀察記錄菌落生長情況；

生理生化和分子相關檢測：

將步驟h中的葉片用液氮速凍后研磨取樣，用于檢測MDA含量、葉綠素含量生理指標，并提取RNA，反轉錄后，用實時熒光定量PCR的方法驗證目標基因表達量。