[發明專利]一種新疆野蘋果抗病基因快速篩選鑒定的方法

在審

• 申請號: 202010150434.5
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111304238A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 張道遠;丁雨;文雪靜;劉曉潔;李小雙;楊紅蘭
• 申請（專利權）人: 中國科學院新疆生態與地理研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12Q1/18;C12Q1/6851
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所(普通合伙) 65106
• 代理人: 張莉

本發明涉及一種新疆野蘋果抗病基因快速篩選鑒定的方法，該方法由目標基因瞬時遺傳轉化、腐爛病原菌接菌、抗病相關表型統計以及生理生化和分子相關檢測完成。該方法用的是整株瞬時遺傳轉化，瞬時侵染整株新疆野蘋果組培苗之后進行接菌處理，從葉片和莖段直觀發病表型、生理生化指標、下游基因的定量驗證三個方面，多維度的全面的快速鑒定抗病相關基因功能。具有短時高效的特點，可以在短時間內篩選鑒定新疆野蘋果體內的抗病相關基因功能，為快速獲得強抗性基因并進行抗病分子機理研究奠定了高效的技術手段和基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及到一種新疆野蘋果抗病基因快速篩選鑒定的方法。

背景技術

新疆野蘋果(Malus sieversii)又名塞威士蘋果，屬蘋果屬，主要分布在中亞的哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、烏茲別克斯坦、塔吉克斯坦和中國的新疆西部山地(閻國榮,許正,2001)。新疆野蘋果種質資源豐富，是我國新疆天山野果林區中珍貴的第三紀孑遺植物，更是世界野蘋果基因庫的重要組成部分，且新疆野蘋果是現代栽培蘋果(Malusdomestica)的祖先種(Velasco et al.2010；Duan et al.2017)。因其自交不親和特性和自然選擇作用形成了許多抗寒抗病蟲、耐貧瘠的特異單株，豐富的變異使新疆野蘋果贏得了廣泛的關注，已經成為蘋果育種主要砧木之一。對伊犁新源縣野蘋果林的研究發現，除去過度放牧和蘋果小吉丁蟲的爆發因素外，致使新源縣新疆野蘋果林大面積死亡的另一個主要誘因即為蘋果腐爛病的爆發引起樹皮腐爛(張艷敏,2009；季英,季榮,黃人鑫,2004；Cui,Liu,Liu,2015)。蘋果腐爛病是由蘋果黑腐皮殼菌(Valsa mali)引起的枝干皮層腐爛病害。黑腐皮殼菌分類地位為：子囊菌門，糞殼菌綱，糞殼菌亞綱，間座殼菌目，黑腐皮殼科，黑腐皮殼屬)(柯希望,2013)。為了從根本上科學的保護新疆野蘋果林，我們必須從新疆野蘋果腐爛病機理入手，從分子水平闡述新疆野蘋果響應病原菌的分子過程，篩選出新疆野蘋果中優良的抗病基因，從而為保護優質蘋果種質和新疆野蘋果中優良的抗病基因奠定堅實基礎。

瞬時表達是一種快速研究基因表達、蛋白質亞細胞定位以及基因間互作的一種重要的手段。相比較穩定轉化體系而言，瞬時轉化具有簡單，快速，經濟，有效的特點(Levy etal.2005；Chen et al.2010)。瞬時轉化體系也廣泛的應用于植株中，其中東北林業大學王玉成團隊發明了一種用農桿菌介導的瞬時轉化系統，該系統可以該系統在煙草、擬南芥、白樺、白楊、柳樹中得到廣泛應用(吳英達，2010；鄭磊，2012；郭勇，2016)。本方法是對王玉成團隊的農桿菌介導的瞬時轉化體系配方進行了一系列優化，包括組培苗齡、侵染時間、溫度、侵染液配方等，以確定適用于新疆野蘋果的最佳侵染體系。以MsMYB44為例，發現通過帶有MYB44過表達載體的農桿菌侵染新疆野蘋果組培苗后，MsMYB44基因表達量最高能達到140倍，且可持續表達直到侵染后第5天，基因表達量維持約20倍左右(圖1)。說明改良過的瞬時侵染體系可以達到過表達目標基因的目的，并在腐爛病發病時間內，可以持續過表達目標基因。

由于新疆野蘋果穩定轉化過程耗時長，大大降低了在新疆野蘋果體系中鑒定基因功能的效率，因此研究發明基因功能快速篩選鑒定體系成為研究重點。利用外植體例如離體葉片、果實和愈傷組織的鑒定基因功能的方法已有報道(陳學森吳樹敬，2018；郝玉金，2019；陳學森，2019)，本方法用的是整株瞬時遺傳轉化方法，瞬時侵染整株新疆野蘋果組培苗之后進行接菌處理，從葉片和莖段直觀發病表型、生理生化指標、下游基因的定量驗證三個方面，多維度的全面的快速鑒定抗病相關基因功能。它具有短時高效的特點，可以幫助我們在短時間內篩選鑒定新疆野蘋果體內的抗病相關基因功能，為快速獲得強抗性基因并進行抗病分子機理研究奠定了高效的技術手段和基礎。

發明內容