[發明專利]一種免提取新型冠狀病毒核酸檢測的方法與試劑盒

在審

• 申請號: 202010147912.7
• 申請日: 2020-03-05
• 公開（公告）號: CN111172327A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 趙丹蕊;郭興中;陳文;方劍秋
• 申請（專利權）人: 杭州丹威生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發明提供一種免提取熒光聚合酶鏈反應(熒光PCR)定性檢測新型冠狀病毒的方法和試劑盒，屬于生物技術與醫學領域。本發明的方法將樣本核酸釋放與擴增融為一體，試劑盒中包含了裂解液和快速酶，可以直接對病人呼吸道分泌物進行裂解與擴增，使整個檢測過程快速，簡便，減少相互污染的機會，獲得的PCR檢測結果準確可靠，能夠盡快確診病人分泌物中是否存在新型冠狀病毒，在疾病監測、臨床診斷等領域具有重要的應用價值。

技術領域：

本發明涉及生物技術與醫學領域，具體涉及了一種用于檢測新型冠狀病毒的方法和試劑盒。適用于新型冠狀病毒感染的檢測和臨床輔助診斷。

背景技術：

新型冠狀病毒肺炎是由新型冠狀病毒(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的疾病。2019年12月，武漢市部分醫療機構陸續出現不明原因肺炎病人，武漢市持續開展流感及相關疾病監測，2020年1月7日，實驗室檢出一種新型冠狀病毒，獲得該病毒的全基因組序列。目前傳染源主要是新型冠狀病毒感染的患者，隱性感染者也可能成為傳染源，主要經呼吸道飛沫傳播和接觸傳播，人群普遍易感。新型冠狀病毒屬于β冠狀病毒屬。進化分析顯示，新型冠狀病毒與來自中華菊頭蝠(中國馬蹄蝠的一種)的蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat severe acute respiratory syndrome-relatedcoronaviruses)最為相似，核苷酸同源性達到84％，與人類SARS病毒的核苷酸同源性達到78％，與MERS病毒的同源性達到約50％。目前尚無明確有效的抗新型冠狀病毒的藥物和疫苗，因此控制疫情的進一步發展主要靠及時的發現和隔離。

實時熒光PCR技術，通過引入特異性探針和熒光信號的動態監測使PCR產物的擴增及分析的全過程可以在單管內封閉完成，并且可以自動分析結果，具有實時、準確、快速、簡便等特點，是一種先進的分子檢測技術。目前已經在臨床上應用的熒光PCR檢測試劑和方法多達上千種；常規的通過熒光PCR檢測病原體核酸的方法一般都需要兩個獨立的過程，一是病原體DNA或RNA核酸模板制備，二是將核酸模板加入到反應體系中進行PCR擴增檢測。各種病原體結構的不同，在各個實驗室使用和建立的核酸處理的試劑和方法也不完全一致。但處理過程基本一致，都需要經過消化裂解、吸附純化、洗滌收集等多個步驟。對于單個樣本的處理往往耗時數十分鐘，需要對大量樣本進行處理時，耗時甚至比PCR檢測反應更長。由于繁多的操作步驟，在大樣本處理過程中，樣本之間的相互污染也不可避免；因防護不當，出現在處理過程中人感染病原體的情況也較為多見。

免提取熒光PCR技術采用優化的PCR緩沖液體系和特殊的DNA聚合酶，減少樣本中存在的多種抑制劑對PCR反應的干擾，具有強活力、高穩定性、強耐受性等特點。該技術無需進行昂貴又費時的核酸抽提過程，使用動物標本或病原體保存液即可直接用于熒光PCR擴增鑒定，極大地簡化了操作步驟和縮短了檢測時間。免提取熒光PCR技術正在逐漸被應用于各項動植物基因的研究中，未來將廣泛應用于臨床病原體檢測，積極地推動分子診斷的發展。

發明內容

本發明的目的在于提供一種免提取新型冠狀病毒核酸檢測的方法和試劑盒，簡化操作步驟，縮短PCR檢測時間。

為實現上述目的，本發明的技術方案是針對于新型冠狀病毒兩個不同的基因編碼區的特異保守區域為靶標區域，設計兩對特異性引物及熒光探針，同時設置了內標質控系統，用于整個反應體系的質量控制。

一種免提取新型冠狀病毒核酸檢測的方法與試劑盒，其包含nCoV反應液、PCR增強劑、nCoV陽性質控品和nCoV陰性質控品。

所述的新型冠狀病毒檢測試劑盒中的nCoV反應液包括引物探針、DNA聚合酶、逆轉錄酶、UNG酶、三磷酸核苷、鎂離子、Tris-HCl、KCl，MgCl₂和TritonX-100。