[發明專利]一種免提取新型冠狀病毒核酸檢測的方法與試劑盒

在審

• 申請號: 202010147912.7
• 申請日: 2020-03-05
• 公開（公告）號: CN111172327A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 趙丹蕊;郭興中;陳文;方劍秋
• 申請（專利權）人: 杭州丹威生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

1.一種免提取新型冠狀病毒核酸檢測的方法與試劑盒，包括nCoV反應液、PCR增強劑、nCoV陽性質控、nCoV陰性質控。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，nCoV反應液含有引物探針、DNA聚合酶、逆轉錄酶、三磷酸核苷、MgCl2、Tris-HCl，KCl，TritonX-100和純化水。

1)引物和熒光探針包括第一對和第二對引物和探針，所述第一對和第二對引物和熒光探針為分別針對新型冠狀病毒兩個不同基因ORF1ab和N基因的保守序列設計的第一對和第二對特異性正反向引物和熒光探針。

ORF1ab基因特異性的正向和反向引物的序列分別是5’-GGCTTCACATATGTATTGTTC-3’，和5’-GCTCAAACTCTTCTTCTTCAC-3’；ORF1ab基因特異性的探針的序列是5’-TCACCTTCTTCTTCATCCTCATCTGG-3’，并且，探針的兩端分別標記有熒光發生基團FAM和熒光淬滅基團BHQ1；

N基因特異性的正向和反向引物的序列分別是5’-AAGGCTTCTACGCAGAAG-3’，和5’-GTGCCTGGAGTTGAATTTC-3’；N基因特異性的探針的序列是5’-AGCCTCTTCTCGTTCCTCATCAC-3’，并且，探針的兩端分別標記有熒光發生基團ROX和熒光淬滅基團BHQ2；

2)nCoV反應液含pH值為8.0～8.8的5-10mmol/L Tris-HCl、5-10mmol/L MgCl₂、30-50mmol/L KCl；

3)nCoV反應液中酶系由熱啟動DNA聚合酶、逆轉錄酶、UNG酶、dNTPs組成，特征在于每人份反應酶系中DNA聚合酶的用量為2U；逆轉錄酶用量為1.5U；UNG酶用量為0.2U；dNTPs為20mmol/L。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于其包含PCR增強劑：甲酰胺、甘油、BSA。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于PCR擴增的條件為：50℃5-20分鐘，96℃30-90秒；96℃1-3秒，58℃6-15秒，45個循環。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述陽性質控品為含有插入新型冠狀病毒冠狀病毒特異型保守序列的pUC57載體質粒，陰性質控品為含人管家基因β-Globin基因序列的TE緩沖液。