[發明專利]一種用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202010147525.3
• 申請日: 2020-03-05
• 公開（公告）號: CN111139309A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 侯紹華;王昭華;林曉;賈紅;姜一瞳;鑫婷
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/90
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 高琦

本發明公開了一種用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒及應用，包括標準品，所述標準品為含有529基因序列的陽性質粒以及針對弓形蟲529基因設計的特異性引物和探針，根據弓形蟲529基因的特異性保守靶序列設計用以定性檢測組織器官、糞便或血液樣品中的弓形蟲529基因，所述引物包括上游引物和下游引物，本發明采用實時熒光RAA技術建立快速檢測弓形蟲的方法，與熒光定量PCR相比具有成本小，簡便快捷的優點，能夠在恒溫36℃、20min內進行檢測，通過便攜式儀器直接讀取檢測結果，該方法最低檢出弓形蟲基因組量為10²拷貝數，靈敏度與傳統熒光定量PCR相當，適于臨床樣本及實驗室快速診斷。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及到一種用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒及應用。

背景技術

剛地弓形蟲是一種胞內寄生蟲，寄生范圍廣泛，幾乎包括所有溫血脊椎動物。剛地弓形蟲病是一種世界性的人畜共患寄生蟲病，由于人類可通過食用受污染的食品或水、與寵物貓密切接觸等多種途徑感染，已對人類健康造成嚴重威脅。據報道世界范圍內有近三分之一的人感染弓形蟲，多為隱性感染。貓是各種易感動物的主要感染源，貓排出的卵囊在外界短期發育便具有感染能力，卵囊可污染土壤、牧草、飼料、飲水和用具等，病人、病畜和帶蟲動物的尸體、肌肉、內臟、血液、滲出物以及急性期病畜的分泌物和排泄物均可帶有弓形蟲生的假囊和包囊，也是重要的感染源。臨床上多數動物是無癥狀的帶蟲者，僅有少數出現癥狀，其癥狀的表現從不明顯的感染到急性致死病不一，孕婦感染后可導致早產、流產、胎兒發育畸形。

目前，已有病原學診斷、免疫學診斷以及分子生物學診斷等傳統方法用于檢測弓形蟲，其中PCR技術檢測特異性及敏感性更好，在臨床樣本檢測時可信度高，更加受檢測者青睞，然而，PCR技術依賴精密昂貴的儀器，檢測時間長，成本高并且需要專業人士操作的特點使其難以普及，在臨床應用過程中有一定的局限性，難以滿足基層檢測的需要。為彌補難以實現現場即時檢測這一空缺，新型等溫擴增技術的出現為臨床工作者帶來了新的福音，該方法克服了依賴精密儀器、檢測時間長等缺陷，尤其適用于基礎設施、實驗設備及試驗技術難以支持使用PCR診斷的地方，具有極其廣泛的應用前景。

重組酶介導擴增(Recombinase-aid Amplification,RAA)是一種恒溫擴增技術，其原理是重組酶結合引物，尋找模板DNA上的同源序列，定位結合后引發鏈置換反應，引物結合到對應模板上，在DNA聚合酶的作用下進行延伸，同時單鏈DNA結合蛋白結合到單鏈，防止雙鏈重新聚合。據悉，該反應在34℃-45℃、5-20分鐘內即可實現樣品的快速擴增。

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有較好的敏感性和特異性，快速準確的檢測到待檢樣本中的弓形蟲基因的用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒及應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明包括標準品，所述標準品為含有529基因序列的陽性質粒，其特征在于，還包括針對弓形蟲529基因設計的特異性引物和探針，根據弓形蟲529基因的特異性保守靶序列設計用以定性檢測組織器官、糞便或血液樣品中的弓形蟲529基因，所述引物包括上游引物和下游引物，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述探針的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

進一步的，所述探針中間熒光報告基團和熒光淬滅基因分別標記在T堿基上，兩個基團中間THF替代G或C，3’端磷酸基團修飾。

作為優選，還包括引物混合液、特異性熒光探針、ABuffer、B Buffer、RAA干粉試劑和ddH2O。

進一步的，包括A Buffer為20％PEG，B Buffer為280mM MgAc。