[發明專利]一種用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202010147525.3
• 申請日: 2020-03-05
• 公開（公告）號: CN111139309A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 侯紹華;王昭華;林曉;賈紅;姜一瞳;鑫婷
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/90
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 高琦

1.一種用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒，包括弓形蟲基因標準品，所述弓形蟲基因標準品為含有529基因序列的陽性質粒，其特征在于，還包括針對弓形蟲529基因設計的特異性引物和探針，根據弓形蟲529基因的特異性保守靶序列設計用以定性檢測組織器官、糞便或血液樣品中的弓形蟲529基因，所述引物包括上游引物和下游引物，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述探針的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

2.根據權利要求1所述的用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒，其特征在于，所述探針中間熒光報告基團和熒光淬滅基因分別標記在T堿基上，兩個基團中間THF替代G或C，3’端磷酸基團修飾。

3.根據權利要求1所述的用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒，其特征在于，還包括引物混合液、特異性熒光探針、ABuffer、B Buffer、RAA干粉試劑和ddH2O。

4.根據權利要求3所述的用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒，其特征在于，包括A Buffer為20％PEG，B Buffer為280mM MgAc。

5.根據權利要求3所述的用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒，其特征在于，所述的RAA干粉試劑的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μLrecA重組酶蛋白或30ng/μL Rad51、30ng/μLBsu DNA聚合酶、100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫蘇糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

6.根據權利要求3所述的用于快速檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒，其特征在于，所述弓形蟲基因標準品的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

7.一種基于RT-RAA技術檢測弓形蟲的方法，其特征在于，操作步驟如下：提取待測樣品的DNA，以待測樣品的DNA為模板，在上游引物、下游引物、探針及RAA干粉試劑、A Buffer、BBuffer和ddH2O存在下進行實時熒光RAA反應，所述熒光RAA反應體系的加入量分別為BufferA 40.9μl，上游引物2μl，下游引物2μl，探針0.6μl，模板2μl；BufferB 2.5μl；根據實時熒光RAA擴增曲線分析待測樣本，確定待測樣本是否含有弓形蟲基因組。

8.如權利要求7所述的一種基于RT-RAA技術檢測弓形蟲的方法，其特征在于：所述上游引物終濃度為400nM；所述下游引物終濃度為400nM，所述探針終濃度為120nM；所述實時熒光RAA反應條件為：36℃，1min，共計20個循環。

9.如權利要求7所述的一種基于RT-RAA技術檢測弓形蟲的方法，其特征在于：所述擴增曲線和CT值分析待測樣本的分析方法包括當待測樣本FAM通道擴增曲線呈“S”型且CT值≤35，判斷為弓形蟲529基因陽性結果，則當前樣本為弓形蟲感染樣本；當待測樣本無明顯擴增曲線且CT值≥40，判斷為弓形蟲529基因陰性結果，則當前樣本為弓形蟲陰性樣本；當待測樣本FAM通道擴增曲線呈“S”型且35＜CT值＜40，判為可疑，需要排除環境污染造成的不準確結果后，再次檢測，若樣本的結果仍然為35＜Ct值＜40，以陰性對照作為參照標準，檢測陰性對照的Ct值，若陰性對照Ct值≥40，則該待測樣本判為陽性。

10.如權利要求1所述的用于檢測弓形蟲的實時重組酶介導等溫擴增核酸試劑盒在病毒檢測中的應用。