[發(fā)明專利]一種基于拉曼光譜的微生物單細(xì)胞生長檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010145970.6
• 申請日: 2020-03-05
• 公開（公告）號: CN111289489B
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 洪喜;李新立;薛瑩;李航;王楠
• 申請（專利權(quán)）人: 長春長光辰英生物科學(xué)儀器有限公司
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;G01N15/10;G01N15/00;C12Q1/04
• 代理公司: 北京挺立專利事務(wù)所(普通合伙) 11265
• 代理人: 高福勇

本發(fā)明一種基于拉曼光譜的微生物單細(xì)胞生長檢測方法，設(shè)計構(gòu)思是基于機(jī)器學(xué)習(xí)中聚類分析算法，結(jié)合培養(yǎng)時間(或ODsubgt;600/subgt;)確定單細(xì)胞的生長時期，通過分析單細(xì)胞拉曼光譜，檢測微生物單細(xì)胞生長過程中胞內(nèi)物質(zhì)生長變化，該方法能快速、靈敏且無需標(biāo)記的檢測微生物單細(xì)胞生長，解決了現(xiàn)有技術(shù)存在耗時、操作繁瑣、勞動力昂貴和試劑敏感等問題，操作簡單，適合推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種單細(xì)胞生長檢測方法，尤其是一種基于拉曼光譜的微生物單細(xì)胞生長檢測方法。

背景技術(shù)

微生物生長分為不同的階段：滯后期(為細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備)，對數(shù)期(以細(xì)胞加倍為特征)、穩(wěn)定期(細(xì)胞生長速率和凋亡速率相等)和死亡期(細(xì)胞死亡)四個生長周期；

在一個封閉的環(huán)境中，由于細(xì)胞的生長，所需的營養(yǎng)液被消耗殆盡，細(xì)胞的群體呈現(xiàn)了生長曲線的各個時期，不同的生長階段具有不同的生化反應(yīng)，以合成細(xì)胞生長和分裂所必須的細(xì)胞成分；準(zhǔn)確識別微生物的生長時期，對于實(shí)時監(jiān)測食品發(fā)酵、生物制藥等工程菌的代謝狀態(tài)，判斷反應(yīng)終點(diǎn)具有重要意義；

現(xiàn)有技術(shù)中，對微生物生長時期的檢測方法主要基于群體細(xì)胞水平，這種群體細(xì)胞檢測方法(如光密度、標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)等)存在耗時、操作繁瑣、需要樣品量大、不適用于連續(xù)監(jiān)測等問題；而且，現(xiàn)有方法也不能描述單個微生物細(xì)胞在生長過程中胞內(nèi)物質(zhì)(如DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等)相對含量所發(fā)生的變化；

如何快速、靈敏的從本質(zhì)上檢測微生物單細(xì)胞在生長過程中所發(fā)生的生化變化，是單細(xì)胞生長研究的重要難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是，提供一種基于拉曼光譜的微生物單細(xì)胞生長檢測方法，該方法能快速、靈敏且無需標(biāo)記的檢測微生物單細(xì)胞生長，解決了現(xiàn)有技術(shù)存在耗時、操作繁瑣、勞動力昂貴和試劑敏感等問題，操作簡單，適合推廣。

一種基于拉曼光譜的微生物單細(xì)胞生長檢測方法，包括如下步驟：

步驟一、在實(shí)驗(yàn)室中，將微生物培養(yǎng)在最適其培養(yǎng)的條件下，并培養(yǎng)至不同生長時期；

作為一種舉例說明，所述微生物包括但不限于：細(xì)菌、真菌、藻類；

步驟二、利用現(xiàn)有生長曲線檢測方法檢測微生物生長時期；測量培養(yǎng)時間為1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物細(xì)胞密度，即OD₆₀₀；

作為一種舉例說明，所述現(xiàn)有生長曲線檢測方法：包括但不限于光密度、比濁法、標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法等；

步驟三、采集不同生長時期的微生物單細(xì)胞拉曼光譜；應(yīng)用拉曼光譜儀，選擇調(diào)整光譜儀參數(shù)，探索最佳參數(shù)設(shè)置，采集所有單細(xì)胞拉曼光譜數(shù)據(jù)；

作為一種舉例說明，分別采集培養(yǎng)時間為1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物單細(xì)胞拉曼光譜，每個時間段采集50組拉曼數(shù)據(jù)，六個時間段共計300組；

步驟四、對微生物單細(xì)胞拉曼光譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，包括如下具體操作：

步驟4.1，對微生物單細(xì)胞拉曼光譜去除宇宙射線；

基于差分法，首先計算微生物單細(xì)胞拉曼光譜各波數(shù)峰強(qiáng)差分，設(shè)置宇宙射線判別閾值，若某點(diǎn)差分大于該閾值，可確定該波數(shù)峰為宇宙射線并選取前后點(diǎn)坐標(biāo)值抹平該宇宙射線，公式可表示為：

式中，為某波數(shù)的差分值，(y_max-y_min)/Δ為宇宙射線判別閾值，Δ為設(shè)置窗口寬度，Y_i為某波數(shù)峰強(qiáng)值，Y_i-1、Y_i+1為其波數(shù)前、后波數(shù)峰強(qiáng)值；

作為一種舉例說明，所述設(shè)置窗口寬度可設(shè)置為2-5個波數(shù)；