[發明專利]一種基于拉曼光譜的微生物單細胞生長檢測方法

有效

• 申請號: 202010145970.6
• 申請日: 2020-03-05
• 公開（公告）號: CN111289489B
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 洪喜;李新立;薛瑩;李航;王楠
• 申請（專利權）人: 長春長光辰英生物科學儀器有限公司
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;G01N15/10;G01N15/00;C12Q1/04
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 高福勇

1.一種基于拉曼光譜的微生物單細胞生長檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、在實驗室中，將微生物在最適其培養的條件下進行培養，并培養至不同生長時期；

步驟二、采用光密度法，測量培養時間為1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物細胞密度，即OD₆₀₀；

步驟三、采集不同生長時期的微生物單細胞拉曼光譜；應用拉曼光譜儀，選擇光譜儀參數，采集所有單細胞拉曼光譜數據；所述采集不同生長時期為：分別采集培養時間為1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物單細胞拉曼光譜，每個時間段采集50組拉曼數據，六個時間段共計300組；

步驟四、對微生物單細胞拉曼光譜進行標準化處理，包括如下具體操作：

步驟4.1，對微生物單細胞拉曼光譜去除宇宙射線；

基于差分法，首先計算微生物單細胞拉曼光譜各波數峰強差分，設置宇宙射線判別閾值，若某點差分大于該閾值，可確定該波數峰為宇宙射線并選取前后點坐標值抹平該宇宙射線，公式可表示為：

式中，為某波數的差分值，(y_max-y_min)/Δ為宇宙射線判別閾值，Δ為設置窗口寬度，Y_i為某波數峰強值，Y_i-1、Y_i+1為其波數前、后波數峰強值；

步驟4.2，應用自適應迭代重加權懲罰最小二乘算法或滑動小波變換對微生物單細胞拉曼光譜進行基線校正；

步驟4.3，對微生物單細胞拉曼光譜進行自適應平滑濾波，設置信噪比閾值，若拉曼光譜信噪比小于所述信噪比閾值，應用Savitzky-Golay卷積平滑算法進行一次平滑處理，再次計算平滑后信噪比，直到信噪比大于所述信噪比閾值；

信噪比計算方法公式：

其中，Y_max和Y_min為全譜段最大最小強度值，y_max和y_min為靜默區最大最小強度值；

步驟4.4，將微生物單細胞拉曼光譜進行無量綱化處理；

步驟五、確定不同培養時間的微生物單細胞所屬生長時期；

用層次聚類算法將微生物單細胞拉曼光譜聚成4個簇，分別對應生長周期的4個時期，統計每個簇中包含各培養時間的單細胞分布情況，將各培養時間段映射到4個生長時期，分析4個生長時期單細胞培養時間的數據分布，設定比例閾值，若各簇中都存在占該簇總數量大于比例閾值的培養時間段，則將該培養時間映射到簇所表示的生長時期；如果最大占比小于所述比例閾值，根據OD₆₀₀值，重新訓練聚類算法，調整簇劃分；

步驟六、求各生長時期微生物單細胞拉曼光譜均譜，確定所求物質峰位、峰寬，并求峰面積；具體操作包括：

步驟6.1，根據步驟五，將簇中占比最大的培養時間所有單細胞的拉曼光譜求均譜；

步驟6.2，確定標準峰位；

步驟6.3，峰面積計算過程具體包括：

6.3.1,用于修正實驗中拉曼光譜峰位偏移，利用小波變換求一維陣列的峰位，通過對每個寬度的小波進行卷積來平滑向量，在足夠長的尺度上出現的具有足夠高信噪比的相對最大值被接受，標記波數范圍和強度，為了消除光譜邊緣效應，去除尋峰結果中首尾譜峰；

6.3.2,基于滑動平滑窗口對峰位進行二次校正，修正不同儀器所測拉曼光譜精確峰位；

6.3.3,特征物質含量計算，

X_i→T_i

其中，X_i表示波數值，T_i表示波數對應序列，S表示選定峰面積，表示胞內物質含量，t₁和t₂表示峰波數的起止位置；

步驟七、不同生長階段單細胞胞內物質變化可視化分析；所述可視化分析包括：蛋白、核酸峰面積隨生長時間變化的柱狀圖，蛋白與核酸比率變化柱狀圖。

2.根據權利要求1所述的一種基于拉曼光譜的微生物單細胞生長檢測方法，其特征在于，所述微生物包括：細菌、真菌、藻類。

3.根據權利要求1所述的一種基于拉曼光譜的微生物單細胞生長檢測方法，其特征在于，所述設置窗口寬度設置為：2-5個波數。

4.根據權利要求1所述的一種基于拉曼光譜的微生物單細胞生長檢測方法，其特征在于，所述snr為：10-20。