[發明專利]一種雙標法檢測精子線粒體膜電位和活性氧的方法

有效

• 申請號: 202010145558.4
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN111289424B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 曾橋;胡西陵
• 申請（專利權）人: 浙江星博生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N21/64
• 代理公司: 寧波高新區核心力專利代理事務所(普通合伙) 33273
• 代理人: 涂蕭愷

本發明公開了一種雙標法檢測精子線粒體膜電位和活性氧的方法，特點是包括待精液自然液化后，取5?10萬條精子加入到37℃預熱的500μL精子培養緩沖液中混勻，并置于37℃水浴箱中加入10uL精子線粒體膜電位和活性氧聯合染液，混勻37℃避光孵育，5?30分鐘內上流式細胞儀機檢測的步驟；最后分別收集三種顏色熒光信號：綠色、橙色和紅色；采用流式細胞儀自帶軟件分析結果，根據綠色和橙色熒光情況，確定線粒體膜電位高低；根據紅色熒光情況，確定活性氧含量情況，優點是實現了一次性完成精子線粒體膜電位和活性氧的檢測，且操作簡單、快速、重復性好。

技術領域

本發明涉及體外診斷試劑領域，特別涉及一種雙標法檢測精子線粒體膜電位和活性氧的方法。

背景技術

線粒體的主要功能是產生能量，為精子運動提供ATP。線粒體的功能狀態對精子存活起著重要作用，因為精子的運動能力與線粒體的活性密切相關，整個精子代謝所需的能量主要由線粒體提供。線粒體活性的改變會影響精子的能量供應。研究表明，線粒體還是細胞凋亡的調控中樞。線粒體膜電位又是啟動細胞凋亡過程最早出現的因子，線粒體膜電位的測定對于精子質量和功能的測定意義尤為重要。因此，線粒體的功能狀態是精子功能質量的一個關鍵性指標。通常對線粒體活性的評價主要通過檢測線粒體的跨膜電位變化來分析。

精子的線粒體上存在著跨膜電位，因此對線粒體活性的檢測主要通過檢測線粒體的跨膜電位變化。目前，檢測精子線粒體活性的熒光探針主要有羅丹明123(Rhodamine123，R123)、MitoTracker Green FM(MITO)和5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘(5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′3，3′-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanineiodide，JC-1)等。雖然JC-1在許多實驗中被廣泛地的實驗，但是其水溶性差的特性也使其很難在一些實驗中使用。即使是在低濃度條件下，JC-1也會在水的緩沖液中析出。JC-10(5，6-Dichloro-1，1′，3，3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide；Enhanced JC-1)是一種可以在需要高濃度染料的實驗中替代JC-1。與JC-1相比，JC-10具有更好的水溶性，JC-10可以選擇性的進入線粒體，認為JC-10是檢測精子線粒體功能最適合的熒光探針，比JC-1染色的特異性更好。JC-10分子式為C₂₅H₂₇Cl₂IN₄，分子量為583.34，在檢測精子線粒體功能過程中，當精子線粒體膜電位低時，以單體形式存在，其激發波長Ex＝490nm，發綠色熒光波長Em＝525nm；當線粒體膜電位高時，形成二聚體，發橙色熒光(發射波長Em＝590nm)。雖然單獨使用JC-10染色能判斷精子線粒體膜電位的高低，但不能準確地判斷精子氧化應激活性氧的狀態。