[發(fā)明專利]一種雙標法檢測精子線粒體膜電位和活性氧的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010145558.4 | 申請日： | 2020-03-04 |
| 公開（公告）號： | CN111289424B | 公開（公告）日： | 2022-07-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 曾橋;胡西陵 | 申請（專利權(quán)）人： | 浙江星博生物科技股份有限公司 |
| 主分類號： | G01N15/14 | 分類號： | G01N15/14;G01N21/64 |
| 代理公司： | 寧波高新區(qū)核心力專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33273 | 代理人： | 涂蕭愷 |
| 地址： | 浙江省寧波*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 雙標法 檢測 精子 線粒體 膜電位 活性氧 方法 | ||
1.一種雙標法檢測精子線粒體膜電位和活性氧的方法，其特征在于包括以下步驟：
（1）待精液自然液化后，取5-10萬條精子加入到37℃預(yù)熱的500μL 精子培養(yǎng)緩沖液中混勻，并置于37℃水浴箱中；
（2）在步驟（1）得到的精子培養(yǎng)緩沖液中加入10μL精子線粒體膜電位和活性氧聯(lián)合染液，混勻37℃避光孵育，5-30分鐘內(nèi)上流式細胞儀機檢測，其中所述的精子線粒體膜電位和活性氧聯(lián)合染液為基于雙激光的一種雙標染色液，適用于雙激光發(fā)射器的流式細胞儀的雙標染色液為由JC-10和弱巰基反應(yīng)性的氯甲基官能團化合物溶于二甲基亞砜配制而成的JC-10與MTCM雙標染色液，所述的JC-10與MTCM雙標染色液中JC-10濃度為1-50μmol/L，MTCM濃度為1-100μmol/L；
（3）分別收集三種顏色熒光信號：綠色、橙色和紅色；采用流式細胞儀自帶軟件分析結(jié)果，根據(jù)綠色和橙色熒光情況，確定線粒體膜電位高低，發(fā)橙色熒光的細胞為膜電位高的細胞，發(fā)綠色熒光的細胞為膜電位低的細胞；根據(jù)紅色熒光情況，確定活性氧含量情況，紅色熒光強的細胞即為活性氧含量高的細胞，紅色熒光弱的細胞即為活性氧含量低的細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙標法檢測精子線粒體膜電位和活性氧的方法，其特征在于步驟（1）所述的精子培養(yǎng)緩沖液配方為：7.4g/L 氯化鈉，0.366g/L碳酸氫鈉，0.285g/L氯化鉀，0.154g/L磷酸氫二鈉，0.153g/L 硫酸鎂，0.083g/L 磷酸二氫鉀，0.044g/L 氯化鈣，5.21g/L Hepes鈉鹽和0.55-1.1g/L D-葡萄糖和10-50g/L人血清白蛋白，pH 值7.0-7.8。
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