[發明專利]一種SSR標記確定水稻混合間栽品種間遺傳分化的方法

有效

• 申請號: 202010144714.5
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN111719011B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 韓光煜;王哲;張文龍;王云月;李勇成;羅瓊;楊楠;蘇正亮
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11;C12Q1/6858
• 代理公司: 昆明金科智誠知識產權代理事務所(普通合伙) 53216
• 代理人: 胡亞蘭

1.一種SSR標記確定水稻混合間栽品種間遺傳分化特異性引物對，其特征在于，所用SSR引物是平均分布于水稻12條染色體上的48個SSR位點，共48對，列表如下：

2.一種SSR標記確定水稻混合間栽品種間遺傳分化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取水稻基因組DNA；

(2)采用如權利要求1所述的48對特異引物，對提取的水稻基因組DNA樣品進行PCR擴增；

(3)利用毛細管電泳方法分離PCR產物，讀取其分子量；

(4)遺傳分化指數的計算：利用數據化的處理SSR分子指紋來計算遺傳分化指數，混合間栽水稻組配品種間的遺傳分化指數的計算公式如下：

其中A_i1和A_i2代表A樣品等位基因在第i個SSR位點上的多態性賦值(0～n)，B_i1和B_i2代表B樣品等位基因在第i個SSR位點上的多態性賦值(0～n)，Max_i為第i個SSR位點上包含所有等位基因多態性條帶賦值的最大值(n)，N代表SSR引物對的總數；

(5)直線回歸分析：利用統計學上的線性相關分析方法，GDI與其稻瘟病防治的相關參數的效應值進行相關性分析。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(1)具體為：

步驟①將水稻種子逐粒放入96孔板中，將96孔板放置于吸水盤上吸收水分，移至光照培養箱，培養至長出幼苗10-20cm，取一株水稻幼苗，加液氮，磨成粉，加入700μL2％的CTAB緩沖液，水浴，再加入氯仿/異戊醇混勻，離心；

步驟②取上清液650μL，轉入已滅菌的離心管，再加入650μL氯仿/異戊醇，充分混勻后離心，取上清液600μL，加入600μL的異丙醇，混勻，冷藏儲存2小時以上，沉淀DNA；

步驟③離心，棄上清液，保留沉淀，加入70％乙醇漂洗兩次除去雜質，離心，收集沉淀，無菌風干水分，加入100μLTE緩沖液或滅菌超純水溶解DNA，搖晃混勻后儲存于-20℃冰箱中備用。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟①中光照培養的條件為28℃，濕度90％，光照12小時；CTAB緩沖液為100mM?Tris-HCl，pH8.0，20mM?EDTA，pH8.0，1.4mol/LNaCl，2％十六烷基三甲基溴化銨。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟①的CTAB緩沖液加入前先將其預熱到65℃，水浴條件為65℃水浴30min-1h。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的氯仿/異戊醇的體積比為24:1。

7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟②中的異丙醇為在在-20℃條件下預冷的。

8.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟(3)中PCR擴增的體系包括：1μL10×buffer，含2mmol/L?MgCl₂、0.8μL?10mmol/LdNTP、0.2μL?10μmol/L正向引物、0.2μL?10μmol/L反向引物、0.05μL?Taq?DNA聚合酶、50ng1μL模板DNA、10μL雙蒸水。

9.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：PCR擴增的條件為：94℃預變性4min……1cycle

94℃30s，55℃30s，72℃30s……30cycles

72℃7min作為最后的延伸階段……1cycle

產物在4℃保存。