[發明專利]一種植物外泌體的提取方法

在審

• 申請號: 202010144341.1
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN113355272A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 潘麗英;胡金波;鄧林濤
• 申請（專利權）人: 上海察雅生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 上海宏京知識產權代理事務所(普通合伙) 31297
• 代理人: 鄧文武

本發明公開了一種植物外泌體的提取方法，包括如下步驟：S1，取植物的地上部分，切小段，浸入NA溶液；S2，從S1的NA溶液中取出葉片，PBS沖洗后，再浸入VIB1溶液中；S3，將葉片從S2的VIB1溶液轉移至VIB2溶液中；S4，將S3的葉片轉移至LY溶液中，搖晃以形成混合體系；S5，將S4中的混合體系進行濾膜過濾，濾液離心兩次，收集上清液；S6，對S5收集后的上清液再次離心，收集上清液；S7，對S6獲得上清液進行離心，去除上清液，獲得水稻外泌體；本發明的提取方法操作簡單，無需大量的細胞培養液即可獲得尺寸在100nm左右的植物外泌體。

技術領域

本發明涉及細胞生物學領域，尤其涉及一種植物外泌體的提取方法。

背景技術

外泌體是指由細胞分泌的包含復雜RNA和蛋白質的小膜泡(30-150nm)，現今，其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。1983年，外泌體首次于綿羊網織紅細胞中被發現，1987年Johnstone將其命名為“exosome”。多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體。其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。外泌體能夠靶向調節細胞的生長發育，成為近幾年醫學研究領域的熱點，越來越多的研究表明中藥有效成分中有外泌體的參與。目前對細胞、體液等外泌體的提取方法主要有差速離心法和PEG沉淀法。而上述兩種方法提取外泌體要求的樣本量非常大，由于植物的特殊性，特別是糧食作物和藥用植物形態、結構各異，獲得大量的植物非原生質液非常困難，并且植物表面存在蠟質和細胞壁，故無法獲得大量的細胞培養液，目前還沒有成熟的具有針對性的植物外泌體提取方法。

發明內容

為了解決現有動物外泌體提取方法無法適用于植物外泌體提取的問題，本發明的目的是提供一種植物外泌體的提取方法。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：一種植物外泌體的提取方法，包括如下步驟：

S1，取植物的地上部分，切小段，浸入NA溶液；

S2，從S1的NA溶液中取出葉片，PBS沖洗后，再浸入VIB1溶液中；

S3，將葉片從S2的VIB1溶液轉移至VIB2溶液中；

S4，將S3的葉片轉移至LY溶液中，搖晃以形成混合體系；

S5，將S4中的混合體系進行濾膜過濾，濾液離心兩次，收集上清液；

S6，對S5收集后的上清液再次離心，收集上清液；

S7，對S6獲得上清液進行離心，去除上清液，獲得水稻外泌體；

其中，NA溶液由400mM NaHCO₃和400mM Na₂CO₃組成；VIB1溶液由20mM MES、2mMCaCl₂和0.1M NaCl組成，VIB1溶液的pH為6.0；VIB2溶液由20mM MES、2mM CaCl₂和0.5M NaCl組成，VIB2溶液的pH為6.0；LY溶液由質量分數為1％的纖維素酶和0.5％的果膠酶組成，LY溶液的pH為6.0。

其中，所述S1中的植物為單子葉植物。

其中，所述S1中的植物為水稻。

其中，所述S1中的浸入時間為3min、所述S2中的浸入時間為5min、所述S3中的浸入時間為10min、所述S4中的搖晃時間為5min。

其中，所述S5中濾膜的尺寸為0.22μm。

其中，所述S5中兩次離心均在4000g、4℃下離心10分鐘。

其中，所述S6中離心在10000g、4℃下離心30分鐘。

其中，所述S7在140000g、4℃下離心1小時。