[發明專利]穩定表達含有海腎熒光素酶的寨卡病毒復制子的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202010142444.4
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN111286492A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 劉娜;胡媛媛;陳凱麗;鄭方亮
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/53;C12Q1/70;C12Q1/02;C12R1/93
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

本發明公開了穩定表達含有海腎熒光素酶的寨卡病毒復制子的構建方法及其應用。本發明構建出了含有海腎熒光素酶Rluc的寨卡病毒的復制子系統，使其可以在細胞中穩定表達，并且可以通過檢測海腎熒光素酶(Renilla luciferase，Rluc)信號來檢測病毒的復制情況。同時可用于抗病毒藥物篩選。

技術領域

本發明涉及寨卡病毒(ZIKV)復制子的構建，特別涉及穩定表達含有海腎熒光素酶Rluc的寨卡病毒ZIKV復制子的構建及其應用。

背景技術

寨卡病毒(ZIKV)是一種蟲媒傳播病毒，與登革病毒、黃熱病毒和西尼羅病毒等都是一個單股正鏈的RNA病毒，屬于黃病毒屬，黃病毒科。自1947年4月從發熱的哨兵恒河猴的血清中分離后，已經在很多國家和地區引起疫情并且流行開來，與嚴重的臨床表現和先天性畸形有關。但是，目前還沒有有效的抗病毒藥物和疫苗可以用于ZIKV的臨床治療，因此對于安全有效的ZIKV抗病毒藥物和疫苗的研究刻不容緩。

寨卡病毒是一個單股正鏈的RNA病毒，長度約11kb，它是一個有包膜的二十面體病毒。ZIKV的RNA開放閱讀框架編碼一個多聚蛋白，在這個開放閱讀框架的兩端分別為長107bp和428bp的5'UTR和3'UTR，開放閱讀框架編碼一個含有3423個氨基酸的多聚蛋白，多聚蛋白可以被病毒和宿主的蛋白酶切割成至少10個單個的蛋白，從N端到C端的順序依次為：C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白。

ZIKV基因組編碼的蛋白中，C、prM和E蛋白為結構蛋白，NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白為非結構蛋白。C蛋白和病毒的RNA一起構成病毒粒子的核心。E蛋白促進病毒粒子和目標膜的融合，負責吸附和進入宿主細胞。prM蛋白斷裂成M蛋白，負責膜蛋白的折疊。七種非結構蛋白行使不同的功能，主要包括：病毒RNA的復制、病毒粒子的形態形成、誘導膜的重排以及病毒對宿主免疫系統的調節。

復制子是一個缺乏編碼病毒結構蛋白基因，卻可以自我復制的系統。在轉染的細胞中，復制子含有病毒復制需要的所有元素，但由于缺少編碼病毒包裝所需要的結構蛋白基因，因此不能包裝出具有感染性的病毒顆粒，但可用于監測病毒在細胞中的復制。

發明內容

本發明的目的是構建出含有海腎熒光素酶Rluc的寨卡病毒的復制子系統，使其可以在細胞中穩定表達，并且可以通過檢測海腎熒光素酶(Renilla luciferase，Rluc)信號來檢測病毒的復制情況。同時可用于抗病毒藥物篩選。

本發明采用的技術方案是：穩定表達含有海腎熒光素酶的寨卡病毒復制子的構建方法，包括如下步驟：

1)CMV-5’UTR-C22片段的克隆：以ZIKVwt-FL為模板，以引物1和引物2為特異性引物，并通過引物設計引入Kpn I限制性酶切位點，PCR擴增寨卡病毒CMV-5’UTR-C22片段(C蛋白5’端22氨基酸對應基因序列)。

所述引物1和引物2的序列為：

引物1：

5’-GGCGGTACCCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA-3’；

引物2：

5’-CTTTCGAAGTCATGGCTACTCCGCGTTTTAG-3’；

PCR反應條件為：95℃預變性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min為一個循環，進行35個循環，最后68℃延伸7min，得CMV-5’UTR-C22片段。