[發(fā)明專利]穩(wěn)定表達(dá)含有海腎熒光素酶的寨卡病毒復(fù)制子的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010142444.4
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN111286492A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉娜;胡媛媛;陳凱麗;鄭方亮
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧大學(xué)
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/53;C12Q1/70;C12Q1/02;C12R1/93
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

1.穩(wěn)定表達(dá)含有海腎熒光素酶的寨卡病毒復(fù)制子的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)CMV-5’UTR-C22片段的克隆：以寨卡病毒ZIKV感染性克隆質(zhì)粒ZIKVwt-FL為模板，以引物1和引物2為特異性引物，并通過引物設(shè)計引入Kpn I限制性酶切位點，PCR擴增寨卡病毒CMV-5’UTR-C22片段；所述引物1和引物2的序列為：

引物1：

5’-GGCGGTACCCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA-3’；

引物2：

5’-CTTTCGAAGTCATGGCTACTCCGCGTTTTAG-3’；

2)Rluc2a片段的克隆：以Rluc-pGEM T為模板，以引物3和引物4為特異性引物，并通過引物設(shè)計引入手足口病的2A切割位點，PCR擴增Rluc2a片段；所述引物3和引物4的序列為：

引物3：

5’-CATAAACTTTCGAAGTCATGGCTACTCCGC-3’；

引物4：

5’-ACGTCTCCCGCAAGCTTGAGAAGGTCAAAATTCAACAGCTGTTGTTCATTTTTGAGAAC-3’；

3)構(gòu)建CMV-5’UTR-C22-Rluc2a片段：以引物1和引物4為特異性引物，以步驟1)獲得的CMV-5’UTR-C22片段和步驟2)獲得的Rluc2a片段為模板，通過重疊延伸PCR，連接CMV-5’UTR-C22和Rluc2a序列，構(gòu)建CMV-5’UTR-C22-Rluc2a片段；

4)E30-NS3片段的克隆：以ZIKVwt-FL為模板，以引物5和引物6為特異性引物，并通過引物設(shè)計引入Cla I限制性酶切位點，PCR擴增E30-NS3片段；所述引物5和引物6的序列為：

引物5：

5’-TTCTCAAGCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCATTGGGTCTGAACACAAAG-3’；

引物6：

5’-TGCTTCTTCTTCAGCATCGATGGC-3’；

5)構(gòu)建CMV-5’UTR-C22-Rluc2a-E30-NS3片段：以引物1和引物6為特異性引物，以步驟3)獲得的CMV-5’UTR-C22-Rluc2a片段和步驟4)獲得的E30-NS3片段為模板，通過重疊延伸PCR，將CMV-5’UTR-C22-Rluc2a和E30-NS3連接在一起，得CMV-5’UTR-C22-Rluc2a-E30-NS3片段；

6)含有海腎熒光素酶的寨卡病毒復(fù)制子Rluc-ZIKV-Rep的構(gòu)建：將步驟5)獲得的CMV-5’UTR-C22-Rluc2a-E30-NS3片段和ZIKVwt-FL，分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Cla I雙酶切，并用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，用CMV-5’UTR-C22-Rluc2a-E30-NS3片段替換ZIKVwt-FL的C基因至NS3基因片段，構(gòu)建含有海腎熒光素酶的寨卡病毒復(fù)制子Rluc-ZIKV-Rep。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1)CMV-5’UTR-C22片段的克隆中，PCR反應(yīng)體系為：ZIKVwt-FL 1ul，引物1和引物2各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO₄3ul，KOD 1ul，ddH₂O 33ul，總體系50ul；PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min為一個循環(huán)，進(jìn)行35個循環(huán)，最后68℃延伸7min，得CMV-5’UTR-C22片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2)Rluc2a片段的克隆中，PCR反應(yīng)體系為：Rluc-pGEM T 1ul，引物3和引物4各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO₄ 3ul，KOD 1ul，ddH₂O 33ul，總體系50ul；PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min為一個循環(huán)，進(jìn)行35個循環(huán)；最后68℃延伸7min，得Rluc2a片段。