[發明專利]基于核酸甲基化變化的心衰檢測裝置和應用

在審

• 申請號: 202010141619.X
• 申請日: 2020-03-03
• 公開（公告）號: CN111411040A
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 余細勇;林忠曉;常繼碩;張靈敏
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學;廣州醫大新藥創制有限公司
• 主分類號: C12M1/40
• 分類號: C12M1/40;C12M1/00
• 代理公司: 北京市英智偉誠知識產權代理事務所(普通合伙) 11521
• 代理人: 劉丹妮;姚望舒

本發明提供了一種基于核酸甲基化變化的心衰檢測裝置和應用。本發明裝置包括：RNA及DNA提取機構、RNA及DNA酶解機構及甲基化RNA及DNA測定機構。本發明發現心肌梗死大鼠心肌組織及外周血中的甲基化率均有增加趨勢，且趨勢具有一致性，提示外周血淋巴細胞可能成為心肌組織的良好替代物，且甲基化率與心肌梗死的嚴重程度呈正相關。初步表明了DNA和RNA甲基化可能在心力衰竭的發生發展中具有一定的潛在作用，可能作為臨床心衰診斷的參考指標。

技術領域

本發明屬于醫學檢測領域，具體涉及一種基于核酸甲基化變化的心衰檢測裝置和應用。

背景技術

近年來，大多數心衰特異性甲基化改變的研究都集中在基因和啟動子特異性改變上，然而全基因組DNA及總RNA甲基化的含量測定對于理解人類心臟疾病的分子病理學，衡量心臟疾病預防的潛在作用，以及監測人體臨床試驗中正在評估的治療藥物的治療效應，仍然是一種有價值的技術手段，是用于監測生物體內大規模表觀遺傳事件的良好的生物標記物。

新的研究證據表明，mRNA的轉錄后修飾對其穩定性、核輸出、細胞分裂、翻譯為蛋白質、降解和干細胞多能性至關重要。在真核細胞的mRNA中，有兩種RNA修飾被廣泛研究：N6-甲基腺苷(m6A)和5-甲基胞嘧啶(m5C)。有研究利用甲基化測序法檢測到人、小鼠及豬衰竭心臟中的m6A水平增加，但限于該方法的高成本及特異性，所以分析了幾種不確定差異甲基化區域的全基因組甲基化分析的檢測方法，主要包括高效液相色譜-紫外技術，目前仍被認為是測定水解DNA樣品中脫氧胞苷和甲基化胞嘧啶含量的金標準，由于需要相對大量(3-10μg)待分析的樣品，該方法的應用受到很大限制。而液相色譜-串聯質譜聯用(LC-MS/MS)作為高效液相色譜-紫外光譜法的替代方法，快速準確，簡便，重現性高，其所需的樣品量要少得多，且該方法的另一個主要優點是不受劣質DNA及RNA的不利影響。

組織是研究表觀遺傳學最直觀的模型，但由于臨床上較難獲取，所以外周血逐漸成為一種替代檢測途徑。冠狀動脈旁路手術的患者采集的外周血白細胞(PBL)和心房活檢的一項研究表明組織間DNA甲基化的高相關性，但針對心力衰竭疾病的心肌組織及外周血中甲基化變化的相關性，心肌梗死的嚴重程度與甲基化率的相關性還沒有經過驗證。現有技術多單純地檢測了心肌梗死患者或實驗動物血液(組織)中全基因組DNA的甲基化，存在一定的局限性，并沒有從RNA方面分析心力衰竭過程中甲基化率的變化，同時沒有針對心力衰竭疾病組織和外周血的關聯性分析。

發明內容

因此，本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供一種基于核酸甲基化變化的心衰檢測裝置和應用。

在闡述本發明的技術方案之前，定義本文中所使用的術語如下：

術語“m6A”是指：N6-甲基腺苷。

術語“m5C”是指：5-甲基胞嘧啶。

術語“dC”是指：2'-脫氧胞苷。

術語“dG”是指：2'-脫氧鳥苷。

術語“rG”是指：鳥苷。

術語“rA”是指：腺苷。

為實現上述目的，本發明的第一方面提供了一種基于核酸甲基化變化的心衰檢測裝置，所述裝置包括：

(1)RNA及DNA提取機構：通過Trizol法提取RNA，通過DNA提取試劑盒提取DNA；

(2)RNA及DNA酶解機構：對所述RNA及DNA提取機構提取到的RNA及DNA進行酶解；

(3)甲基化RNA及DNA測定機構：對所述RNA及DNA酶解機構得到的產品進行電噴霧電離質譜-超高效液相色譜分析。

根據本發明第一方面的裝置，其中，所述Trizol法包括以下步驟：