[發明專利]基于核酸甲基化變化的心衰檢測裝置和應用

在審

• 申請號: 202010141619.X
• 申請日: 2020-03-03
• 公開（公告）號: CN111411040A
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 余細勇;林忠曉;常繼碩;張靈敏
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學;廣州醫大新藥創制有限公司
• 主分類號: C12M1/40
• 分類號: C12M1/40;C12M1/00
• 代理公司: 北京市英智偉誠知識產權代理事務所(普通合伙) 11521
• 代理人: 劉丹妮;姚望舒

1.一種基于核酸甲基化變化的心衰檢測裝置，其特征在于，所述裝置包括：

(1)RNA及DNA提取機構：通過Trizol法提取RNA，通過DNA提取試劑盒提取DNA；

(2)RNA及DNA酶解機構：對所述RNA及DNA提取機構提取到的RNA及DNA進行酶解；

(3)甲基化RNA及DNA測定機構：對所述RNA及DNA酶解機構得到的產品進行電噴霧電離質譜-超高效液相色譜分析。

2.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述Trizol法包括以下步驟：

(1)向液氮下凍存的心肌組織中加入Trizol裂解液，研磨成漿液狀；向-80℃凍存的血液淋巴細胞中加入Trizol裂解液，劇烈渦旋振蕩；

(2)室溫孵育使核蛋白物完全溶解，加入氯仿渦旋，室溫孵育；

(3)離心取上清液至無核酶的EP管中；

(4)加入異丙醇，室溫孵育，離心，沉淀RNA；

(5)棄上清，室溫干燥，加入75％的乙醇漂洗2次，離心；

(6)棄上清，室溫干燥至無明顯的乙醇味，分別向組織RNA和血液淋巴細胞RNA中加入無核酶水，經超微量分光光度計檢測后-80℃冷凍備用。

3.根據權利要求1或2所述的裝置，其特征在于，所述RNA及DNA提取機構中還包括：將提取的RNA及DNA樣本經超微量分光光度計檢測，測定提取純度和濃度。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的裝置，其特征在于，所述RNA及DNA酶解機構中，所述酶解包括以下步驟：

(1)將DNA和RNA樣品混合加無核酶水，加熱，迅速置于冰上冷卻，離心；

(2)加入S1核酸酶和10×S1核酸酶緩沖液，37℃孵育；

(3)在步驟(1)所得混合物中加入堿性磷酸酶、10×堿性磷酸酶緩沖液、磷酸二酯酶及水，37℃孵育酶解；

優選地，所述酶解還包括以下步驟：

(4)酶解后取用瓊脂糖凝膠電泳檢驗酶解效果。

5.根據權利要求4所述的裝置，其特征在于，所述步驟(1)中，所述基因組DNA的量為200ng～1μg，優選為300ng～600ng，最優選為500ng；和/或

所述RNA的量為500ng～1.5μg，優選為800ng～1.2μg，最優選為1μg。

6.根據權利要求4或5所述的裝置，其特征在于，所述步驟(1)中，所述加熱溫度為90～100℃，優選為95℃；

所述加熱時間為1～10min，優選為3～8min，最優選為5min；和/或

所述冷卻時間為1～5min，優選為1～3min，最優選為2min。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的裝置，其特征在于，所述甲基化RNA及DNA測定機構中，所述電噴霧電離質譜條件為：

毛細管電壓1500～6000V，優選為3000～4000V；

噴嘴電壓0～2000V，優選為500V，其中，正模式0～500V，負模式1000～2000V；

干燥氣溫度300～350℃，優選為300℃；

干燥氣流速8～12L·min^-1，優選為8.0L·min^-1；

霧化氣壓力10～55psi，優選為35psi；

鞘氣溫度250～400℃，優選為350℃；和/或

鞘氣流速10～12L·min^-1，優選為11.0L·min^-1。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的裝置，其特征在于，所述甲基化RNA及DNA測定機構中，所述超高效液相色譜條件為：

流動相A為含0.05～0.2％優選為0.1％甲酸的超純水；

流動相B為含0.05～0.2％優選為0.1％甲酸的甲醇；

流速為0.1～0.5mL·min^-1，優選為0.2mL·min^-1；

柱溫20～50℃，優選為35℃；

進樣量1～10μL，優選為5μL。