[發(fā)明專利]一種RANKL重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010141417.5
• 申請(qǐng)日: 2020-03-04
• 公開（公告）號(hào): CN111286516A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王東;閔雯嫣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/12;C12N15/10;A61K38/17;A61K48/00;A61P1/02;A61P19/08
• 代理公司: 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 徐思波

本發(fā)明提供了一種RANKL重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下過程：(1)體外分子克隆技術(shù)，獲得小鼠RANKL基因全長(zhǎng)；(2)通過測(cè)序，明確已獲得克隆序列與數(shù)據(jù)庫中的序列完全一致；進(jìn)一步通過基因重組技術(shù)將小鼠RANKL基因重組于pET?32a表達(dá)載體中，成功構(gòu)建RANKL重組蛋白表達(dá)載體。本發(fā)明還提供一種RANKL重組蛋白表達(dá)載體在制備治療骨代謝異常相關(guān)疾病方面的應(yīng)用。其中，所述骨代謝異常相關(guān)疾病包括骨硬化癥及尖周肉牙腫病。本發(fā)明中的RANKL重組蛋白表達(dá)載體，可以通過在體外誘導(dǎo)表達(dá)大量RANKL重組蛋白，最后通過RANKL重組蛋白促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能，從而治療和改善骨硬化癥及尖周肉牙腫病。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種RANKL重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，對(duì)于骨硬化癥及尖周肉牙腫的治療治療主要局限于傳統(tǒng)藥物或顯微外科手術(shù)，但常染色體異常引起的骨硬化癥嚴(yán)重的病人中無法取得較好的效果，主要是由于骨代謝過程中破骨細(xì)胞的功能異常引起的；在目前的研究中表明RANKL在調(diào)控破骨細(xì)胞分化及活化具有重要作用；而骨代謝疾病的發(fā)生大多與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成及破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收密切相關(guān)，但是，如何構(gòu)建RANKL尚未明確。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種RANKL重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實(shí)施例提供一種RANKL重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下過程：(1)體外分子克隆技術(shù)，獲得小鼠RANKL基因全長(zhǎng)；(2)通過測(cè)序，明確已獲得克隆序列與數(shù)據(jù)庫中的序列完全一致；進(jìn)一步通過基因重組技術(shù)將小鼠RANKL基因重組于pET-32a表達(dá)載體中，成功構(gòu)建RANKL重組蛋白表達(dá)載體。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)中體外分子克隆技術(shù)，獲得小鼠RANKL基因全長(zhǎng)，具體包括以下過程：

(1-1)小鼠頭蓋骨樣本RNA提取及RT-PCR；

(1-1-1)分離出生后1-3天內(nèi)的小鼠頭蓋骨組織，通過TRIZOL進(jìn)行組織RNA的提取；將分離到的頭蓋骨組織轉(zhuǎn)移至1.5ml RNase-free EP管中，加入1ml Trizol裂解液，使用勻漿器將制成組織懸液后置于冰上裂解10min；

(1-1-2)加入200μl三氯甲烷，置于渦旋儀劇烈振蕩15s，室溫靜置5min后12000rpm離心15min；離心溫度均為4℃；

(1-1-3)小心取出離心管，此時(shí)可見管內(nèi)液體分為3層，小心吸取無色上清至新EP管中，再加入異丙醇500μl，上下輕柔顛倒混勻，靜置10min后12000rpm離心10min；

(1-1-4)棄去上清，用1ml 75％乙醇將RNA沉淀清洗一遍，12000rpm離心5min；

(1-1-5)棄去上清，靜置待剩余酒精揮發(fā)；

(1-1-6)用RNase-free水溶解RNA；測(cè)定并記錄RNA的濃度與OD值，做好標(biāo)記儲(chǔ)存在-80℃中；

(1-2)RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：使用Takara RR047A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，將500ng RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA；

(1-2-1)去除基因組體系如下：

(1-2-2)冰上配制并混和去基因組體系各組分后，于PCR儀上42℃2min，

4℃放置；逆轉(zhuǎn)錄體系如下：