[發(fā)明專利]一種RANKL重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010141417.5
• 申請(qǐng)日: 2020-03-04
• 公開（公告）號(hào): CN111286516A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王東;閔雯嫣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/12;C12N15/10;A61K38/17;A61K48/00;A61P1/02;A61P19/08
• 代理公司: 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 徐思波

1.一種RANKL重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下過程：(1)體外分子克隆技術(shù)，獲得小鼠RANKL基因全長(zhǎng)；(2)通過測(cè)序，明確已獲得克隆序列與數(shù)據(jù)庫中的序列完全一致；進(jìn)一步通過基因重組技術(shù)將小鼠RANKL基因重組于pET-32a表達(dá)載體中，成功構(gòu)建RANKL重組蛋白表達(dá)載體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RANKL重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(1)中體外分子克隆技術(shù)，獲得小鼠RANKL基因全長(zhǎng)，具體包括以下過程：

(1-1)小鼠頭蓋骨樣本RNA提取及RT-PCR；

(1-1-1)分離出生后1-3天內(nèi)的小鼠頭蓋骨組織，通過TRIZOL進(jìn)行組織RNA的提取；將分離到的頭蓋骨組織轉(zhuǎn)移至1.5ml RNase-free EP管中，加入1ml Trizol裂解液，使用勻漿器將制成組織懸液后置于冰上裂解10min；

(1-1-2)加入200μl三氯甲烷，置于渦旋儀劇烈振蕩15s，室溫靜置5min后12000rpm離心15min；離心溫度均為4℃；

(1-1-3)小心取出離心管，此時(shí)可見管內(nèi)液體分為3層，小心吸取無色上清至新EP管中，再加入異丙醇500μl，上下輕柔顛倒混勻，靜置10min后12000rpm離心10min；

(1-1-4)棄去上清，用1ml 75％乙醇將RNA沉淀清洗一遍，12000rpm離心5min；

(1-1-5)棄去上清，靜置待剩余酒精揮發(fā)；

(1-1-6)用RNase-free水溶解RNA；測(cè)定并記錄RNA的濃度與OD值，做好標(biāo)記儲(chǔ)存在-80℃中；

(1-2)RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：使用Takara RR047A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，將500ng RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA；

(1-2-1)去除基因組體系如下：

(1-2-2)冰上配制并混和去基因組體系各組分后，于PCR儀上42℃2min，4℃放置；逆轉(zhuǎn)錄體系如下：

(1-2-3)冰上配制好逆轉(zhuǎn)反應(yīng)體系；再混勻去基因組體系，于PCR儀上37℃30min，85℃5s，4℃∞，最終得到的產(chǎn)物用RNase-free水稀釋10倍作為RT-PCR反應(yīng)模板備用；

(1-2-4)設(shè)計(jì)引物克隆mRNAKL基因

上游引物：NcoI-CCATGG–CTCCAGCTATGATGGAAGGCTC；

下游引物：XhoI-CTCGAG–TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG；

冰上配制好PCR反應(yīng)體系如下：

(1-2-5)PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳分理處目的片段，目的片段大小應(yīng)該在525bp范圍；通過膠回收試劑盒回收擴(kuò)增出的產(chǎn)物片段；

(1-2-6)產(chǎn)物進(jìn)行末尾加A反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：

加A產(chǎn)物與T載體連接，反應(yīng)體系如下：

(1-2-7)連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化：

(1-2-7-1)取10ul上述連接好的質(zhì)粒，按照9:1加入solution III，輕輕混勻后，加入100ul DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕談勻，4℃冰浴30min，42℃熱激90s，4℃冰浴5min，加入450ul LB培養(yǎng)基，150rpm，37℃,45min；同時(shí)，制備藍(lán)白斑篩選平板，取10ul IPTG，40ul X-gal及30ul Amp均勻涂布與LB固體平板上備用；

(1-2-7-2)搖菌結(jié)束后3000rpm離心5min，棄上清，重懸于100ul LB培養(yǎng)基中，均勻涂布于含有Amp+(30ul)，IPTG(10ul)及X-gal(40ul)平板中，37℃過夜培養(yǎng)；

(1-2-7-3)通過藍(lán)白斑篩選，挑取白色單克隆菌落進(jìn)行搖菌擴(kuò)增后送測(cè)序。