[發明專利]一種RANKL重組蛋白表達載體的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202010141417.5
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN111286516A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 王東;閔雯嫣
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;C12N15/10;A61K38/17;A61K48/00;A61P1/02;A61P19/08
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 徐思波

1.一種RANKL重組蛋白表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下過程：(1)體外分子克隆技術，獲得小鼠RANKL基因全長；(2)通過測序，明確已獲得克隆序列與數據庫中的序列完全一致；進一步通過基因重組技術將小鼠RANKL基因重組于pET-32a表達載體中，成功構建RANKL重組蛋白表達載體。

2.根據權利要求1所述的一種RANKL重組蛋白表達載體的構建方法，其特征在于，所述步驟(1)中體外分子克隆技術，獲得小鼠RANKL基因全長，具體包括以下過程：

(1-1)小鼠頭蓋骨樣本RNA提取及RT-PCR；

(1-1-1)分離出生后1-3天內的小鼠頭蓋骨組織，通過TRIZOL進行組織RNA的提??；將分離到的頭蓋骨組織轉移至1.5ml RNase-free EP管中，加入1ml Trizol裂解液，使用勻漿器將制成組織懸液后置于冰上裂解10min；

(1-1-2)加入200μl三氯甲烷，置于渦旋儀劇烈振蕩15s，室溫靜置5min后12000rpm離心15min；離心溫度均為4℃；

(1-1-3)小心取出離心管，此時可見管內液體分為3層，小心吸取無色上清至新EP管中，再加入異丙醇500μl，上下輕柔顛倒混勻，靜置10min后12000rpm離心10min；

(1-1-4)棄去上清，用1ml 75％乙醇將RNA沉淀清洗一遍，12000rpm離心5min；

(1-1-5)棄去上清，靜置待剩余酒精揮發；

(1-1-6)用RNase-free水溶解RNA；測定并記錄RNA的濃度與OD值，做好標記儲存在-80℃中；

(1-2)RNA逆轉錄合成cDNA：使用Takara RR047A逆轉錄試劑盒進行RT-PCR反應，將500ng RNA逆轉成cDNA；

(1-2-1)去除基因組體系如下：

(1-2-2)冰上配制并混和去基因組體系各組分后，于PCR儀上42℃2min，4℃放置；逆轉錄體系如下：

(1-2-3)冰上配制好逆轉反應體系；再混勻去基因組體系，于PCR儀上37℃30min，85℃5s，4℃∞，最終得到的產物用RNase-free水稀釋10倍作為RT-PCR反應模板備用；

(1-2-4)設計引物克隆mRNAKL基因

上游引物：NcoI-CCATGG–CTCCAGCTATGATGGAAGGCTC；

下游引物：XhoI-CTCGAG–TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG；

冰上配制好PCR反應體系如下：

(1-2-5)PCR反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳分理處目的片段，目的片段大小應該在525bp范圍；通過膠回收試劑盒回收擴增出的產物片段；

(1-2-6)產物進行末尾加A反應，反應體系如下：

加A產物與T載體連接，反應體系如下：

(1-2-7)連接產物進行轉化：

(1-2-7-1)取10ul上述連接好的質粒，按照9:1加入solution III，輕輕混勻后，加入100ul DH5a感受態細胞中，輕輕談勻，4℃冰浴30min，42℃熱激90s，4℃冰浴5min，加入450ul LB培養基，150rpm，37℃,45min；同時，制備藍白斑篩選平板，取10ul IPTG，40ul X-gal及30ul Amp均勻涂布與LB固體平板上備用；

(1-2-7-2)搖菌結束后3000rpm離心5min，棄上清，重懸于100ul LB培養基中，均勻涂布于含有Amp+(30ul)，IPTG(10ul)及X-gal(40ul)平板中，37℃過夜培養；

(1-2-7-3)通過藍白斑篩選，挑取白色單克隆菌落進行搖菌擴增后送測序。