[發明專利]基于海藻酸鈉-鉑納米粒子氧化酶活性的原花青素檢測方法

有效

• 申請號: 202010141065.3
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN113358592B
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 陳偉;何少斌;鄧豪華;楊柳;林秀玲
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

1.一種基于海藻酸鈉-鉑納米粒子氧化酶活性的原花青素檢測方法，其特征是利用生物相容性好且無毒的海藻酸鈉作為納米材料的保護劑來制備海藻酸鈉-鉑納米粒子，所合成的材料在溫和條件下就能快速催化溶解氧產生O₂^??并氧化3,?3’,?5,?5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽產生顏色反應，并利用其良好的內在模擬氧化物酶活性對原花青素進行檢測；包括顯色體系在450?nm處的吸光度值隨著所加入原花青素濃度的升高而明顯下降；當反應體系中原花青素的濃度達到1?mmol/L時，顏色反應幾乎被完全抑制；因此，原花青素是可以一定程度上抑制海藻酸鈉-鉑納米粒子溶液的氧化酶催化活性，可以用肉眼觀察根據顯色體系溶液顏色深淺初步判斷所含原花青素濃度的大小；

根據顯色體系在波長450?nm處的吸光度差值ΔA₄₅₀對原花青素終濃度以10為底的對數值繪制標準工作曲線，于是，便可實現對原花青素實際樣品的定量檢測，所述的ΔA_450?=A_0?-?A_t，其中A₀和A_t分別是不含原花青素和存在相應濃度原花青素時，反應產物在450?nm處的吸光度；標準工作曲線在原花青素濃度為4~32.5?μmol/L范圍內具有很好的線性，ΔA_450?=?1.1791·lgC_OPC+?3.1941，相關系數為0.999，在OPC濃度為10?μmol/L，n=9下相對標準偏差RSD為0.6%，最低檢測限為2.0?μmol/L；

以1?mmol/L的抗壞血酸對該檢測體系的抗氧化能力定義為1?U，最終檢測得葡萄籽樣品中原花青素的抗氧化能力為2.85?U/mg；再選取不同濃度的原花青素標準品溶液10?μmol/L、15?μmol/L、20?μmol/L，分別加入到樣品溶液中并混合均勻后加入到顯色體系，再重復測定步驟分別測定它們的吸光度值，并將所得吸光度代入標準曲線，得到葡萄籽樣品中原花青素的加標回收率；在三個不同濃度的加標水平下，葡萄籽中原花青素的加標回收率為97.0?%至98.6?%，均在95-105?%要求的標準范圍內，相對標準偏差在0.5-3.4?%范圍之間。

2.?根據權利要求1所述的一種基于海藻酸鈉-鉑納米粒子氧化酶活性的原花青素檢測方法，其特征是所使用的海藻酸鈉-鉑納米粒子由下述方法制備的：稱取0.1?g海藻酸鈉溶解于50?mL濃度為1?%（v/v）?的醋酸中，攪拌15?min使海藻酸鈉完全溶解即得到0.2%（m/v）的海藻酸鈉溶液；再將2?mL濃度為10?mmol/L?氯鉑酸加入到47?mL?0.2%（m/v）的海藻酸鈉溶液中，避光渦旋攪拌，然后逐滴加入1?mL濃度為0.2?mol/L新配制的硼氫化鈉溶液，并于5min之內加完，暗處攪拌，得到海藻酸鈉-鉑納米粒子，其中鉑元素的質量濃度為78.03?mg/L。

3.?根據權利要求1或2所述的一種基于海藻酸鈉-鉑納米粒子氧化酶活性的原花青素檢測方法，其特征是在有溶解氧存在的溶劑中，無過氧化氫的參與下，海藻酸鈉-鉑納米材料可以催化O₂所生成的O₂^??，且所生成的O₂^??可與抗壞血酸反應而被抗壞血酸清除，使得抗壞血酸在250?nm處的紫外特征吸收峰消失，是一種新型的氧化模擬酶。

4.?根據權利要求1或2所述的一種基于海藻酸鈉-鉑納米粒子氧化酶活性的原花青素檢測方法，其特征是在有氧氣的條件下，陰極O₂還原峰在-0.34?V處出現；而在通氮情況下，去除氧氣后，沒有峰出現；這表明海藻酸鈉-鉑納米粒子是一種新型的氧化模擬酶，能夠催化氧氣發生氧化還原反應。

5.?根據權利要求1或2所述的一種基于海藻酸鈉-鉑納米粒子氧化酶活性的原花青素檢測方法，其特征是對顯色反應造成影響的幾種因素，包括反應體系的pH值，反應體系的溫度以及反應體系的底物濃度等，利用單因素的控制變量法，進行逐一優化，以確定氧化反應外在條件的影響；通過測定450?nm處的吸光度A₄₅₀，以確定利于顏色反應的最佳條件；對于所構建的海藻酸鈉-鉑納米粒子-TMB顯色體系，其最適反應條件為：50?mmol/L磷酸緩沖溶液的pH為4.5、反應體系的反應溫度為37?°C、反應時間為5分鐘、底物3,?3’,?5,?5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液的濃度為0.15?mmol/L。