[發明專利]一種高產雄烯二酮的重組分枝桿菌及構建方法及應用

有效

• 申請號: 202010140954.8
• 申請日: 2020-03-03
• 公開（公告）號: CN111454871B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 齊崴;尤生萍;張偉;常紅星;錢建武;蘇榮欣
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P33/02;C12R1/32
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

本發明公開了一種高產雄烯二酮的重組分枝桿菌及構建方法及應用，構建方法為：將膽固醇氧化酶基因ChoM2、攜帶有RBS片段的甾酮C27單加氧酶基因Smo2和攜帶有RBS片段的17β?羥固醇脫氫酶基因Hsd4A導入新金分枝桿菌(Mycobacterium sp.)CICC 21097中，得到高產雄烯二酮的重組分枝桿菌MN_CSH；本發明的方法獲得的重組菌株發酵主要產物為4?雄烯二酮，收率90％以上，選擇性達90％以上，降低副產物生成，提高雄烯二酮產量。與原始菌株相比，重組菌具有更好的催化轉化性能，可以提高生產效率。工藝方法簡便，效率高。

技術領域

本發明屬于生物技術和生物化工領域，具體涉及一種高產雄烯二酮的重組分枝桿菌及構建方法及應用。

背景技術

甾體激素類藥物是指分子結構中含有甾體結構的激素類藥物，是臨床上一類重要的藥物，主要包括腎上腺皮質激素和性激素兩大類。甾體激素類藥物因具有眾多藥理作用，如抗感染、抗過敏、抗病毒和抗休克等，而被廣泛用于治療各種疾病，如風濕病、心血管疾病、癌癥、皮膚病以及內分泌失調等。甾體激素類藥物經過幾十年的研究開發，目前已經形成種類繁多、臨床應用廣泛和需求旺盛的一大類甾體藥物，成為僅次于抗生素的第二大藥物。

雄甾-4-烯-3,17-二酮(英文名稱：androst-4-ene-3,17-dione，簡稱：雄烯二酮或4-AD)，其外觀形狀為近白色晶體粉末，無異味，無毒性，不溶于水。雄烯二酮最初是從精巢或尿中提取出的具有雄性激素作用的一種甾類化合物，后經研究發現其對機體起著重要的調節作用。雄烯二酮現已成為制備甾體激素類藥物不可替代的中間體，幾乎所有的甾體激素類藥物都可以4-AD為原料進行生產，可用于生產性激素、孕激素以及蛋白同化激素，又可用于制備氫化可的松、氧化潑尼松及黃體酮等100余種藥物。

雄烯二酮的全球市場約為800億美元并且以每年20％的速度增長。我國制藥企業每年對雄烯二酮的需求量約為6000噸，然而我國雄烯二酮的年生產能力僅為1000噸左右，與市場需求有很大差距。

目前，我國雄烯二酮的生產主要存在兩種途徑，一是薯蕷皂苷元途徑，二是微生物轉化途徑，市場上兩種途徑生產的雄烯二酮大致各占一半。然而，其中薯蕷皂苷元途徑(從薯蕷(黃姜)中分離皂苷生產雄烯二酮)生產過程復雜，成本較高，污染嚴重，許多地方已禁止生產。微生物轉化途徑(利用微生物轉化植物甾醇或膽固醇生產雄烯二酮)具有生產成本低、生產步驟簡化等優勢，越來越受到廣大廠商的關注和重視。隨著生物技術的進一步發展，全球市場上微生物轉化法生產雄烯二酮的比例將會快速增長，并且市場前景非常誘人。

由于目前有些微生物制甾藥工藝的相對落后以及高效菌株和生產線的引進需要巨額開支，使得大多數企業長期依賴既有的傳統生產模式。近年來，隨著某些企業開始大力引進優秀甾藥轉化微生物及發酵工藝，激素類藥物的生產模式已大為改觀。從1998年以來便開始采用微生物轉化植物甾醇生產雄烯二酮的工藝，而攻克微生物發酵生產激素的技術一直是本領域科技人員多年的努力方向，甾藥微生物轉化技術的改進和發展還有很長的路要走。

目前，微生物轉化植物甾醇生產雄烯二酮存在的主要問題有：菌株轉化能力較差，甾藥在轉化工程中易被降解，并有副產物產生等，嚴重影響生產效益。

發明內容

本發明的目的在于提供一種可減少副產物產生，提高植物甾醇制備雄烯二酮的轉化效率的一種高產雄烯二酮的重組分枝桿菌的構建方法。

本發明的第二個目的是提供一種高產雄烯二酮的重組分枝桿菌。

本發明的第三個目的是提供一種高產雄烯二酮的重組分枝桿菌發酵生產雄烯二酮的應用。

本發明的技術方案概述如下：