[發(fā)明專利]一種腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡的定量方法

在審

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• 申請日: 2020-03-03
• 公開（公告）號: CN111235243A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設計）人: 田慶常;曹曉環(huán);羅汝婳;劉蒙蒙
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

一種腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡的定量方法，屬于生物技術及醫(yī)學定量技術領域。本發(fā)明方法包括以下步驟：（1）構建抗體?DNA復合物；（2）從樣品中分離純化得到總外泌體/胞外囊泡，采用步驟（1）所述抗體?DNA復合物標記腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡；（3）對經步驟（2）標記的腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡進行QPCR定量檢測。本發(fā)明方法實現(xiàn)了腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡的定量檢測，適用范圍廣，成本較低，可以用于多種腫瘤靶標的定量檢測和定性檢測。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術及醫(yī)學定量技術領域，具體涉及一種腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡的定量方法。

背景技術

外泌體/胞外囊泡是一類微小胞外的囊泡，含有豐富的功能生物大分子，如蛋白質，核酸，脂類。外泌體/胞外囊泡可通過其攜帶的蛋白質、核酸、脂類等來調節(jié)受體細胞的生物學活性，參與細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲機體、免疫應答、抗原提呈等方面，可作為細胞組織間的轉移信號分子。另外腫瘤細胞分泌的特定外泌體/胞外囊泡具有作為疾病檢測的生物標志物的潛能。因此外泌體/胞外囊泡在腫瘤診斷中扮演著舉足輕重的地位，開發(fā)一種行之有效的外泌體/胞外囊泡精確定量方法對于惡性腫瘤的診療具有重大意義。現(xiàn)有定量外泌體/胞外囊泡的技術有比色法、熒光法、電化學方法、表面離子共振法及表面增強拉曼法等。比色分析法是一種通過測量特定波長的光吸收程度來測定有色物質濃度的方法。金納米粒子 (Au NPs) 由于具有超高的消光系數而被廣泛應用于比色分析中；還有科學家通過單壁碳納米管 (s-SWCNTs) 和適配體的相互作用建立了一種肉眼可見的比色方法檢測外泌體。

鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)是近年來發(fā)展出的生物放大系統(tǒng)。鏈霉親和素是鏈霉菌培養(yǎng)物重點的一種蛋白，肽鏈中色氨酸殘基可以與生物素結合，它們之間的結合力是抗原與抗體之間結合力的1萬倍，且極其穩(wěn)定。此外，每個鏈霉親和素分子具有4個亞基，可以與4個生物素分子結合。鏈霉親和素和生物素可偶聯(lián)抗體等生物大分子，也可被酶、膠體金、放射性同位素和熒光素標記，作級聯(lián)放大反應。因此應用的鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)建立了許多生物大分子的分析方法。

發(fā)明內容

針對上述現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡的定量方法。本發(fā)明通過構建一種利用抗體-DNA復合物標記和定量腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡，能夠間接反映腫瘤細胞與正常細胞的差異。

為了實現(xiàn)上述目的，采用以下技術方案：

一種腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡的定量方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）構建抗體-DNA復合體；

（2）從樣品中分離純化得到總外泌體/胞外囊泡，采用步驟（1）所述抗體-DNA復合物標記腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡；

（3）對經步驟（2）標記的腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡進行QPCR定量檢測。

所述的一種腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述步驟（1）中構建的方法為：抗體和DNA分別生物素化處理后，將生物素化抗體和生物素化DNA混合，再加入鏈霉親和素分子混合反應，或者將生物素化抗體和鏈霉親和素分子混合，再加入生物素化DNA混合反應，得到抗體-DNA復合體。

所述的一種腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述生物素化抗體為根據檢測腫瘤抗原的不同所選用的偶聯(lián)生物素的抗體；所述生物素化DNA為一端帶有生物素的DNA模板，其長度為10-1000 核苷酸，優(yōu)選長度為20-100 核苷酸。

所述的一種腫瘤特異性外泌體/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述生物素化抗體與鏈霉親和素的分子數量比例為：1:4-1:1000，優(yōu)選1:10-1:50，所述鏈霉親和素與生物素化DNA的分子數量比例小于1:4。