[發明專利]一種對食蟹猴干細胞熒光示蹤的方法

有效

• 申請號: 202010135784.4
• 申請日: 2020-03-02
• 公開（公告）號: CN111265673B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 牛昱宇;吳俊模;王芳;李夢佳
• 申請（專利權）人: 云南中科靈長類生物醫學重點實驗室
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;G01N21/64
• 代理公司: 北京眾澤信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11701
• 代理人: 張艷萍

本發明公開了一種對食蟹猴干細胞熒光示蹤的方法，方法包括：通過食蟹猴皮膚建立纖維細胞系，對纖維細胞進行重編程，獲得食蟹猴誘導多能干細胞；根據熒光素酶基因設計引物對，熒光素酶基因與引物對進行PCR反應；限制性內切酶對AAVS1載體質粒和PCR反應產物熒光素酶基因片段進行酶切，T4連接酶連接限制酶切后的產物得到重組AAVS1?熒光素酶質粒，重組質粒插入食蟹猴誘導多能干細胞中；將獲得熒光素酶標記基因的細胞和熒光素底物靜脈注射進食蟹猴體內后，放入小動物活體成像儀體內進行熒光成像。采用本方法能夠無創、有效監測細胞移植后在體內的存活能力、移動位置、分布情況與增殖情況等一系列生物學變化，為大型動物細胞移植的安全性和有效性提供實時性的參考數據。

技術領域

本發明屬于細胞移植技術領域，涉及一種對食蟹猴干細胞熒光示蹤的方法。

背景技術

非人靈長類動物模型與人類在基因水平具有高度相似性，其與患者的癥狀比嚙齒類動物模型和其他動物的癥狀更為接近，這對于理解疾病的機理，探究新的治療方法的有效性具有巨大潛力。干細胞治療已被廣泛認為是治療和治愈復雜疾病的一種新型治療方法，食蟹獼猴多能干細胞(PSC)在形態，基因表達特征和生長特性方面與人多能干細胞相似，但與小鼠多能干細胞存在差異，這表明獼猴可能是回答某些關鍵問題的最佳模型。

傳統研究細胞的移植效果主要是通過病理組織切片來進行評估,然而,這種方法不適用于監測細胞在活體內的生物學行為。熒光素與底物反應之后，在大動物體內難以通過小動物活體成像儀觀察，本專利使用的熒光素酶是一種高靈敏度的新型熒光素酶，將熒光素酶標記的干細胞注射進食蟹猴體內，可有效的觀察到干細胞在食蟹猴體內的分布情況與增殖情況，為臨床前干細胞治療提供參考。

生物發光成像技術被應用到細胞示蹤領域,不僅可以無創、實時的評價干細胞移植情況,為客觀動態評價干細胞在多種疾病治療中的作用機制及生物學行為提供可能,還可以減少實驗動物的數量以及由于實驗動物個體差異而引起的誤差。熒光素酶是一種具有生物活性的蛋白質,它在活體內無毒、無放射性、可代謝、可透過各種細胞膜和血腦屏障,且不會影響生物體正常生理功能。AAVS1位點是位于人19號染色體上PPP1R12C基因第一個內含子中的一段特定序列,在該區域內引入外源核苷酸序列已被證明不會影響PPP1R12C基因或其他內源基因的表達,并且對細胞的毒性小,是一個經過驗證后確保插入靶基因正常轉錄且不影響鄰近基因表達的安全港位點。CRISPR/Cas9系統在靶標基因組位點產生雙鏈斷裂位點后,可通過保真度高的同源重組修復將目的基因的敲入。通過核轉儀將構建的質粒轉入細胞核中，Cas9內切酶切割雙鏈DNA，且有一段具有熒光素酶基因的高度同源的DNA修復模板存在的情況下，生物體內啟動修復路徑，將熒光素酶基因定點插入食蟹猴干細胞基因內部。

發明內容

為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種對食蟹猴干細胞熒光示蹤的方法。

為達到上述目的，本發明的技術方案為：一種對食蟹猴干細胞熒光示蹤的方法，包括以下步驟：

(1)通過食蟹猴皮膚建立纖維細胞系，通過重編程小因子對成纖維細胞進行重編程，獲得食蟹猴誘導多能干細胞；

(2)根據熒光素酶基因設計引物對熒光素酶-F、熒光素酶-R；

(3)熒光素酶基因與引物對熒光素酶-F、熒光素酶-R進行PCR反應；

(4)PCR反應產物進行電泳獲得熒光素酶基因片段，然后進行膠回收；使用SalI和MluI限制性內切酶對AAVS1載體質粒和PCR反應產物熒光素酶基因片段進行酶切；

(5)對酶切后的產物AAVS1-1載體質粒和熒光素酶-1基因片段電泳和膠回收，用T4連接酶連接酶切后的產物AAVS1-1載體質粒和熒光素酶-1基因片段，得到重組AAVS1-熒光素酶基因質粒；