[發明專利]一種對食蟹猴干細胞熒光示蹤的方法

有效

• 申請號: 202010135784.4
• 申請日: 2020-03-02
• 公開（公告）號: CN111265673B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 牛昱宇;吳俊模;王芳;李夢佳
• 申請（專利權）人: 云南中科靈長類生物醫學重點實驗室
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;G01N21/64
• 代理公司: 北京眾澤信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11701
• 代理人: 張艷萍

1.一種用于熒光示蹤的食蟹猴干細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)通過食蟹猴皮膚建立纖維細胞系，通過重編程小因子對成纖維細胞進行重編程，獲得食蟹猴誘導多能干細胞；

(2)根據熒光素酶基因設計引物對熒光素酶-F、熒光素酶-R；

(3)熒光素酶基因與引物對熒光素酶-F、熒光素酶-R進行PCR反應；

(4)PCR反應產物進行電泳獲得熒光素酶基因片段，然后進行膠回收；使用SalI和MluI限制性內切酶對AAVS1載體質粒和PCR反應產物熒光素酶基因片段進行酶切；

(5)對酶切后的產物AAVS1-1載體質粒和熒光素酶基因片段電泳和膠回收，用T4連接酶連接酶切后的產物AAVS1-1載體質粒和熒光素酶-1基因片段，得到重組AAVS1-熒光素酶基因質粒；

(6)將多能干細胞消化成單細胞，再將重組AAVS1-熒光素酶基因質粒與單細胞混合后進行電轉；測定核轉后的多能干細胞基因序列,確定是否含有熒光素酶基因；電轉產物中篩選出熒光素酶標記的細胞，用玻璃針將帶有熒光素酶標記的細胞挑出轉移到新的培養基中培養，多次傳代擴大培養；

所述引物對熒光素酶-F、熒光素酶-R序列為：

熒光素酶-F:5'-ACGCGTCGACGCCACCATGGAGGACGCCA-3'，

熒光素酶-R:5'-CGACGCGTTCACACGGCGATCTTGCCGT-3'。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反應體積為50μl，擴增程序為:95℃3min；(95℃30s,65℃30s,72℃60s)×40；72℃5min，反應產物保存溫度為4℃。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組AAVS1-熒光素酶基因質粒轉化到多能干細胞中方法如下：

(1)重組AAVS1-熒光素酶基因質粒與多能干細胞混合，冰浴5min，42度熱激60秒；

(2)快速放入冰浴中2min后加入無抗的LB液體培養基；

(3)將含有多能干細胞的菌液加到對應抗性的LB平板上，均勻涂開培養。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述LB液體培養基加入量為200ul，所述培養溫度及時間為37℃過夜培養。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述篩選熒光素酶標記細胞采用嘌呤霉素。