[發明專利]一種大規模生產黃芪毛狀根的方法

在審

• 申請號: 202010135220.0
• 申請日: 2020-03-02
• 公開（公告）號: CN111226793A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 張秀娟;白朕卿;隨洋;田雨;吳佳文;高新新;陳啟淵;張宇森
• 申請（專利權）人: 內蒙古自治區生物技術研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N15/82;A01H5/06;A01H6/00
• 代理公司: 佛山粵進知識產權代理事務所(普通合伙) 44463
• 代理人: 王儲

本發明提供了一種大規模生產黃芪毛狀根的方法，包括黃芪無菌苗的制備、農桿菌的活化和培養，毛狀根的預培養和共培養，毛狀根的擴大培養步驟，該方法制備得到的黃芪毛狀根具有高的黃芪甲苷含量，同時，本發明所述方法具有可在保證黃芪甲苷含量的基礎上，穩定高產黃芪毛狀根，并有生產周期短、生產品質統一、適應常溫生長條件的優點。

技術領域

本發明涉及一種大規模生產黃芪毛狀根的方法，屬于黃芪生物技術培育技術領域。

背景技術

黃芪屬于豆科多年生草本植物，以根入藥，迄今已有2000多年的歷史。黃芪的主要藥理作用有補氣固表、利尿、托毒排膿、生肌等療效，主治氣短、虛脫、心悸、自汗、體虛浮腫、慢性腎炎、脫水、久瀉、氣虛、氣血不足、中氣下陷，有抗菌消炎、降壓利尿、解毒利膽等功效，是一種常用中草藥。

隨著人們日益增長的保健觀念的強化，黃芪的需求量將會逐年增加，但目前黃芪的野生資源逐年減少，栽培品種下降且面臨農藥污染和重金屬殘留等問題的困擾。因此應用現代生物技術提高黃芪的產量，改善其品質，探索工業化生產的可行途徑對黃芪的生產具有重要意義，黃芪甲苷是中國藥典規定的含測指標，如果能尋找到提高黃芪甲苷含量的人工黃芪產品，將具有良好的開發和應用前景。

發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)對植物的侵染是自然界中天然的遺傳轉化模式，它通過所含有的致根質粒(Ri)的一部分(T-DNA)在植物基因組中的整合和表達,導致毛狀根的產生。毛狀根具有生長快速、多分支、無向地性和激素自養的特點，而且毛狀根的生理生化、遺傳性能穩定。毛狀根同時還保持了植物正常根的某些生化功能，能夠高效生產次生代謝產物，特別適用于替代植物根部有效成分的生產。自從1997年Ackermann第一次利用發根農桿菌成功轉化高等植物以來，至今已建立了超過100種植物毛狀根的培養系統，其中有不少是藥用植物。例如黃花煙草、曼陀羅、顛茄、莨菪、長春花、紫草、辣根的毛狀根小規模培養已經成功。利用毛狀根培養技術大規模生產藥用植物的有效次生代謝產物呈現出十分誘人的前景，同時對于保護野生資源與生態環境，實現可持續發展也具有積極的意義。而用發根農桿菌Ri質粒誘導蒙古黃芪建立發根培養的無性繁殖體系,可以為資源的開發利用研究提供一條可行的新途徑。

發明內容

本發明的目的是克服黃芪毛狀根中有效成分含量不同、品質不一的不足，同時利用生物技術來保護我們珍貴的土壤資源，提供一種工業化大規模生產黃芪毛狀根的方法，可在保證黃芪甲苷含量的基礎上，穩定地高產黃芪毛狀根。

為了實現上述目的，本發明提供一種大規模生產黃芪毛狀根的方法，包括以下步驟：

步驟1.制備黃芪無菌苗

將黃芪種子用自來水浸泡20-24h后，放入70％乙醇中浸泡1-3min，用無菌水沖洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用無菌水沖洗5-10遍；接種至提前滅菌的MS培養基上，溫度25-30℃，濕度50-60％培養，獲得黃芪無菌苗；

步驟2.菌種活化和培養

將農桿菌加入到液體YEB培養基中于26-28℃，220-250rpm下培養至OD600值為0.5-0.6；然后，將菌液在1/2MS液體培養基中進行培養，于26-28℃下150-180rpm培養20-30min；

步驟3.材料預培養和共培養

將無菌苗的葉，莖，下胚軸、葉柄轉接至添加植物激素的MS培養基上，避光培養1-2天，誘導愈傷組織；然后，再與步驟2中的菌液充分接觸，于50-60rpm，25-28℃下共培養30-40min；

步驟4.除菌

將步驟3的愈傷組織加入到含500mg/L的頭孢噻肟鈉(cef)的1/2MS固體培養基上，于25℃下避光培養；并間隔一周更換新的培養基，同時逐漸降低頭孢噻肟鈉(cef)的濃度；