[發明專利]一種大規模生產黃芪毛狀根的方法

在審

• 申請號: 202010135220.0
• 申請日: 2020-03-02
• 公開（公告）號: CN111226793A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 張秀娟;白朕卿;隨洋;田雨;吳佳文;高新新;陳啟淵;張宇森
• 申請（專利權）人: 內蒙古自治區生物技術研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N15/82;A01H5/06;A01H6/00
• 代理公司: 佛山粵進知識產權代理事務所(普通合伙) 44463
• 代理人: 王儲

1.一種大規模生產黃芪毛狀根的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1.制備黃芪無菌苗

將黃芪種子用自來水浸泡20-24h后，放入70％乙醇中浸泡1-3min，用無菌水沖洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用無菌水沖洗5-10遍；接種至提前滅菌的MS培養基上，溫度25-30℃，濕度50-60％培養，獲得黃芪無菌苗；

步驟2.菌種活化和培養

將農桿菌加入到液體YEB培養基中于26-28℃，220-250rpm下培養至OD600值為0.5-0.6；然后，將菌液在1/2MS液體培養基中進行培養，于26-28℃下150-180rpm培養20-30min；

步驟3.材料預培養和共培養

將無菌苗的葉，莖，下胚軸、葉柄轉接至添加植物激素的MS培養基上，避光培養1-2天，誘導愈傷組織；然后，再與步驟2中的菌液充分接觸，于50-60rpm，25-28℃下共培養30-40min；

步驟4.除菌

將步驟3的愈傷組織加入到含500mg/L的頭孢噻肟鈉(cef)的1/2MS固體培養基上，于25℃下避光培養；并間隔一周更換新的培養基，同時逐漸降低頭孢噻肟鈉(cef)的濃度；

待根長度達到3cm后將其分離出來，放于含有50mg/L的頭孢噻肟鈉(cef)的1/2MS固體培養基上，并間隔一周繼代一次，繼代三次后，將其放于無頭孢噻肟鈉(cef)的1/2MS固體培養基上培養；

步驟5.毛狀根擴大培養

將步驟4的毛狀根轉入6,7-V液體培養基中，于25-28℃，100-130rpm下進行擴大培養，并且每18-20天繼代一次。

2.根據權利要求1所述的一種大規模生產黃芪毛狀根的方法，其特征在于：所述黃芪種子選自蒙古黃芪種子，或膜莢黃芪種子的一種。

3.根據權利要求1所述的一種大規模生產黃芪毛狀根的方法，其特征在于：所述MS培養基的每升的組成如下：

大量元素：KNO3 4-6mM，Ca(NO3)2·4H2O 4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO40.8-1.2mM，

微量元素：H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O 0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O 0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM；

有機物質：肌醇80-100μM，蔗糖100-150μM，水解酪蛋白300-500μM。

4.根據權利要求1所述的一種大規模生產黃芪毛狀根的方法，其特征在于：所述1/2MS培養基的組成是將MS培養基中的大量元素的用量減半。

5.根據權利要求1所述的一種大規模生產黃芪毛狀根的方法，其特征在于：所述農桿菌菌株選自ATCC15834,LBA9402的一種。

6.根據權利要求1所述的一種大規模生產黃芪毛狀根的方法，其特征在于：所述步驟3中的植物激素為IBA、NAA的一種，含量是0.1-0.3mg/L。

7.根據權利要求1所述的一種大規模生產黃芪毛狀根的方法，其特征在于：所述液體YEB培養基的制備方法如下：取酵母粉1g,牛肉膏5g,蛋白胨5g,蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g溶于1L蒸餾水，用氫氧化鈉調至pH 7.4，于121℃，高壓滅菌20min。