[發明專利]一種土赤殼屬真菌的特異性引物、試劑盒及分子檢測方法

有效

• 申請號: 202010133777.0
• 申請日: 2020-02-28
• 公開（公告）號: CN111154909B
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發明（設計）人: 高微微;盧曉紅;焦曉林;張西梅;邵慧慧;畢艷孟;李俊飛
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京睿陽聯合知識產權代理有限公司 11758
• 代理人: 張穎;王朋飛

本發明涉及用于檢測土赤殼屬真菌的特異性引物對及其應用，具體公開了通過PCR擴增檢測土赤殼屬真菌的特異性引物、檢測方法及試劑盒。本發明的引物對、試劑盒以及檢測方法能夠對樣品中是否存在土赤殼屬真菌的進行檢測，具有特異性強、靈敏度高、簡單快速的特點，可用于快速、靈敏地檢測植物、土壤、水等環境中的土赤殼屬真菌，對快速診斷、早期預警病害發生和指導病害防治具有重要意義。

技術領域

本發明屬于病原菌檢測領域，尤其是涉及植物病原真菌的分子檢測。

背景技術

土赤殼屬(Ilyonectria)是2011年建立的新屬，在分類地位上屬于子囊菌門(Ascomycota)、盤菌亞門(Pezizomycotina)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌亞綱(Hypocreomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、叢赤殼科(Nectriaceae)?！癷lyo”在希臘語中是“泥土”的意思，因其為土壤棲居菌而獲此屬名，通常以無性型進行繁殖與侵染，其模式種為I.radicicola，有性型特征為子囊殼單生，表面具有疣狀物，子囊殼壁外層由薄壁的球形大細胞構成，子囊孢子表面光滑；無性型以產生小分生孢子和厚垣孢子而區別于其他屬(Booth,1996；Mantiri et al.,2001；Samuels and Brayford,1990)。

土赤殼屬真菌引起多種植物根部病害，并且同一種植物病害通常由多種土赤殼真菌引起。例如引起西洋參銹腐病的病原菌主要包括I.crassa、I.mors-panacis和I.vredehoekensis(Cabral et al.,2012a；Seifert et al.,2003；Zhang et al.,2019)。引起葡萄黑根病的病原菌包括I.estremocensis、I.alcacerensis、I.novozelandica、I.macrodidyma和I.vivaria等(Cabral et al.,2012b；Berlanas et al.,2020)。引起山龍眼科花卉植物黑根病的病原菌包括I.capensis、I.leucospermi、I.protearum和I.vredehoekensis等(Lombard et al.,2013)。在我國，共報道了10個種的Ilyonectria屬真菌：I.mors-panacis,I.robusta,I.changbaiensis,I.communis、I.qitaiheensis、I.vredehoekensis、I.hubeiensis、I.radicicola、I.estremocensis、I.pseudodestructans(Lu et al.,2019；Zhang et al.,2019；Zhuang et al.,2007；ZengZhuang,2013；Mao et al.,2014；Lu et al.,2014；王玉君等，2015)，他們大多數為人參、西洋參、三七等名貴中藥材的病原菌，給這些名貴中藥材的生產帶來了嚴重的經濟損失。

土赤殼屬真菌多為土壤習居菌，寄生性較弱，能夠產生大量厚垣孢子在土壤中長期存活(Chaverri et al.,2011)，只有當環境條件適宜時才會侵染寄主植物引起病害的發生(Tewoldemedhin et al.,2011a；Tewoldemedhin et al.,2011b)。因此，通常情況下，即使田間未觀察到病害，土壤或植物體內也很有可能已經存在該類病原物，所以及時檢測土壤、植物體中的土赤殼屬真菌，盡早采取病害預防措施以避免病害的發生發展尤為重要。

目前對于土赤殼屬真菌的檢測主要采用常規分離培養鑒定的方法。然而，土赤殼屬真菌的生長速度通常較慢，常受其他真菌菌落的限制，甚至被其他真菌菌落覆蓋而影響分離；培養鑒定對操作人員的技術要求高，時間周期長。分子檢測的方法有多重巢式PCR(multiplex nested PCR)，需要采用兩對引物分別進行PCR，不僅耗時，而且多次PCR可能增加系統誤差(Agustí-Brisach et al.,2013)。所以需要改進現有的土赤殼屬真菌的檢測方法，建立高效、省時、簡便、高靈敏度，并且滿足同時檢測引起同一種病害的所有土赤殼屬真菌要求的方法。

發明內容