[發明專利]一種利用質譜定量技術對基因毒性物質進行鑒定的方法

有效

• 申請號: 202010133755.4
• 申請日: 2020-03-02
• 公開（公告）號: CN111257405B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 徐華;謝劍煒;瞿敏敏;陳佳;徐斌;郭磊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/72;C12Q1/02
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 杜仙;劉海羅

本申請涉及一種利用質譜定量技術對基因毒性物質進行鑒定的方法。具體地，本申請涉及一種利用LC?MS/MS對樣品中下述蛋白的特征性多肽片段進行定量分析的方法：H2AX、γ?H2AX、H3和/或p?H3。通過該方法可靈敏和準確的定量區分不同毒作用模式的基因毒性物質，而且能夠動態監測基因毒性物質影響DNA損傷、修復及轉錄的全過程，可用于基因毒性的快速篩查和定量評估。

技術領域

本發明涉及基因毒性檢測領域，具體涉及一種利用質譜定量技術對基因毒性物質進行鑒定的方法。

背景技術

由于受空氣、水、食品及藥品等污染，人類不可避免地會接觸有毒物質。基因毒性物質屬于有毒物質中重要的一類，它們能夠直接或間接損傷DNA，導致基因突變、染色體斷裂或非整倍體損傷，且有致癌性可能。近年來已屢次發生已上市藥品因存在痕量的基因毒性雜質而被強行召回的案例，例如2018年浙江華海藥業、2019年輝瑞日本分公司先后由于在纈沙坦原料藥中檢出了微量致癌物N-亞硝基二甲胺(NDMA)等雜質，而被迫召回已上市產品，給企業和社會造成了巨大的經濟損失。目前各國的法規機構如ICH、FDA和EMA等都對新藥研發中的基因毒性雜質提出了明確及嚴格的控制和檢測要求。如何構建基因毒性篩查、鑒別、分類和定量分析技術，已成為新時期醫藥研究等領域的新挑戰。

目前的基因毒性測試方法已經由傳統的動物體內實驗轉向體外測試方法。至今已發展的基因毒性體外評價方法包括：細菌致突變Ames試驗、淋巴瘤細胞Tk基因突變試驗、單細胞凝膠電泳試驗和微核試驗等，這些方法已被較廣泛應用，但遺憾的是，依然不適用于早期的高通量快速篩選、靈敏度和特異性仍有待提升以解決常見的假陽性問題、尤其是無法實現對基因毒性的準確定量。系列瓶頸問題的存在，極大限制了上述技術的進一步推廣應用。更重要的是，現有技術不能夠區分兩類重要的基因毒性物質，即致染色體斷裂化合物和非整倍體化合物。不同作用模式的基因毒性物質，其與癌癥性的相關性差異顯著，在候選藥物的前期篩選過程中將會被決定不同的去留命運：致染色體斷裂化合物會直接被淘汰，而非整倍體化合物則可先被留下參與后續的臨床前研究。因此，亟待尋求新的途徑以建立滿足上述要求的基因毒性測試新方法。

H2AX是組蛋白2A家族成員之一，當DNA受到紫外線、電離輻射和基因毒性化合物等損傷作用后，尤其是發生DNA雙鏈斷裂后，H2AX蛋白C端139位的絲氨酸殘基快速發生磷酸化，形成磷酸化組蛋白H2AX即γ-H2AX。γ-H2AX是DNA損傷的生物標志物，已被明確為致染色體斷裂化合物基因毒性的特異性效應指標。p-H3是指組蛋白H3的10位絲氨酸發生磷酸化，在有絲分裂過程中，H3S10經Aurora激酶作用而發生磷酸化，以促使染色質凝集和染色體分離，眾多研究已證實p-H3是細胞有絲分裂的生物標志物，是非整倍體基因毒性特異性效應指標。在基因毒性測試體系中，引入γ-H2AX和p-H3的組合分析策略，可望在檢測基因毒性的同時實現對不同基因毒性作用模式的評價。

目前國內外研究γ-H2AX和p-H3的手段主要局限于免疫學方法，例如免疫印跡法和酶聯免疫吸附試驗等。上述方法具有特異性較好、直觀的優點，但是其受限于抗體，不可避免免疫學方法中的一些缺陷，而更重要的是存在著共同的短板：無法對γ-H2AX和p-H3進行準確定量，進而無法實現對基因損傷、修復及轉錄具體過程的定量評估。

發明內容

在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。

如未特別說明，本文中對氨基酸位點的描述，均是以活性蛋白(例如組蛋白H3，H2AX)的野生型全長序列為基礎的。