[發明專利]一種利用質譜定量技術對基因毒性物質進行鑒定的方法

有效

• 申請號: 202010133755.4
• 申請日: 2020-03-02
• 公開（公告）號: CN111257405B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 徐華;謝劍煒;瞿敏敏;陳佳;徐斌;郭磊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/72;C12Q1/02
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 杜仙;劉海羅

1.一種定量分析細胞DNA損傷的方法，其包括以下步驟：

(1)平行條件下設置受試組和陰性對照組；

(2)分別收集受試組細胞以及陰性對照組細胞，并提取細胞核；

(3)從步驟(2)得到的細胞核中提取組蛋白并定量；

(4)用下述方法檢測步驟(3)所得組蛋白中H2AX和/或γ-H2AX的摩爾含量：

a1)用胰蛋白酶對樣品進行水解，得到含H2AX特征性多肽片段多肽1和/或γ-H2AX特征性多肽片段多肽2的水解樣品；

a2)以同位素標記的多肽1作為多肽1的內標；和/或以同位素標記的多肽2作為多肽2的內標，用LC-MS/MS對所述水解樣品進行檢測，得到所述水解樣品中多肽1和/或多肽2的質量濃度；

a3)根據步驟a2)結果等摩爾計算得到樣品中H2AX和/或γ-H2AX的摩爾含量；其中，

多肽1：ATQASQEY，其為H2AX第135-142位氨基酸片段；

多肽2序列與多肽1相同，但其絲氨酸被磷酸化；

用下述方法檢測步驟(3)所得組蛋白中H3和p-H3的摩爾含量：

b1)用胰蛋白酶對樣品進行水解，得到含H3特征性多肽片段多肽3和/或p-H3特征性多肽片段多肽4，其中，在水解前后對樣品進行丙酰基化處理；

b2)以同位素標記的多肽3作為多肽3的內標；和/或以同位素標記的多肽4作為多肽4的內標，用LC-MS/MS對所述水解樣品進行檢測，得到所述水解樣品中多肽3和/或多肽4的質量濃度；

b3)根據步驟b2)結果等摩爾計算得到樣品中H3和/或p-H3的摩爾含量；其中，

多肽3為H3第9-17位氨基酸片段，且9-位，14-位以及N末端經烷基化或酰基化修飾，其中，H3第9-17位氨基酸片段為KSTGGKAPR；

多肽4序列與多肽3相同，但其絲氨酸被磷酸化；

其中，采用反相色譜柱對所述水解樣品進行分離，所述反相色譜柱為ACQUITY?UPLCBEH?C18(1.7μm，2.1×100mm)；其中，

色譜分離條件為：流動相A：0.1％甲酸水溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0-100％B；流速為0.1-1.2mL/min，進樣量范圍為0.1-20μL，柱溫范圍為20℃-60℃；

采用正離子多反應監測模式MRM進行質量掃描，其中質量分析條件為：電噴霧ESI離子源；離子源溫度范圍為300℃-550℃，霧化氣GS1和輔助加熱干燥氣GS2流量范圍為40-60psi，噴霧電壓范圍為2.0-5.5kV；

(5)如受試組細胞中γ-H2AX與H2AX的摩爾含量比值相較于陰性對照組升高，則判定受試細胞染色體斷裂；

如受試細胞中p-H3與H3的摩爾含量比值相較于陰性對照組升高，則判定受試細胞紡錘體受損。

2.權利要求1所述的方法，在步驟(3)中，采用酸抽提法、RIPA緩沖液水解法或組蛋白提取試劑盒提取組蛋白。

3.權利要求1所述的方法，步驟(3)中所述同位素為¹³C和/或¹⁵N。

4.一種評價物質對基因的毒性的方法，其包括以下步驟：

(1)將受試細胞暴露于有效濃度的所述物質中至少0.1小時，同時設立陰性對照組；

(2)按照權利要求1中步驟(2)-(5)定量分析細胞DNA損傷；

(3)如判定受試細胞染色體斷裂，則所述物質為致染色體斷裂物質；

如判定受試細胞紡錘體受損，則所述物質為紡錘體毒劑。

5.權利要求4所述的方法，其中所述細胞為具有藥物代謝酶的敏感細胞。

6.權利要求4所述的方法，其中所述細胞為HepG2細胞或HeLa細胞。

7.權利要求4所述的方法，在步驟(1)中，將受試細胞暴露于有效濃度的所述物質中0.1-24小時。

8.權利要求4所述的方法，在步驟(1)中，所述陰性對照組為DMSO組。

9.一種高通量評價化合物對基因的毒性的方法，其包括采用權利要求1-8任一項所述的方法對化合物對基因的毒性進行評價的步驟。