[發(fā)明專利]一種地龍1H NMR指紋圖譜的構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010129845.6
• 申請(qǐng)日: 2020-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN111272894A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何盼;李震宇;秦雪梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/86;G01N30/64;G01N30/06
• 代理公司: 太原申立德知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

本發(fā)明屬于指紋圖譜構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種地龍1H NMR指紋圖譜的構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明采用核磁共振技術(shù)獲得地龍指紋圖譜及特征峰，能同時(shí)表征地龍中29個(gè)化學(xué)成分，包括氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸類等多種代謝產(chǎn)物，不受物質(zhì)是否具有紫外吸收、以及色譜柱是否保留的限制，能全面反映地龍的化學(xué)成分及品質(zhì)，通過多元統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)合所指認(rèn)物質(zhì)的單變量分析，可用于地龍飲片的質(zhì)量均一性控制。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于指紋圖譜構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種地龍1H NMR指紋圖譜的構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

地龍來源于鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)、通俗環(huán)毛蚓Pheretima vu1garis Chen、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥體。前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“滬地龍”。廣地龍春季至秋季捕捉，滬地龍夏季捕捉，及時(shí)剖開腹部，除去內(nèi)臟和泥沙，洗凈，曬干或低溫干燥。

地龍為我國(guó)傳統(tǒng)蟲類中藥，具有清熱定驚、通絡(luò)，平喘，利尿的功效，臨床上有明顯的抗凝活性。地龍中含有豐富化學(xué)成分，包括蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸、酶類、微量元素等。有研究報(bào)道(中藥地龍的活性成分及藥理作用分析，中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理CHSM 28，2015；地龍?zhí)崛∥锏目鼓饔茫胁菟帲?8 卷第5期，2007；地龍抗凝血活性物質(zhì)研究進(jìn)展，江漢大學(xué)學(xué)報(bào)，第45卷第1 期，2017)，地龍中游離的氨基酸、核苷酸等小分子物質(zhì)及蚓激酶、纖維蛋白溶解酶為其抗凝血活性成分。現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》對(duì)地龍的質(zhì)量控制除了性狀、顯微鑒別外，理化鑒別以賴氨酸、亮氨酸及纈氨酸為對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照。

地龍飲片的來源廣泛，不僅有多種基原，而且產(chǎn)地較多，不同批次地龍藥材的質(zhì)量均一性對(duì)于保證臨床藥效非常重要，現(xiàn)行藥典方法可以進(jìn)行地龍飲片的真?zhèn)舞b別，無法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行均一性評(píng)價(jià)。已有研究(專利CN 1844912A) 報(bào)道了地龍的HPLC指紋圖譜，該專利所建立的地龍指紋圖譜采用C18色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。地龍中的游離氨基酸等小分子物質(zhì)與其抗凝血活性密切相關(guān)，這些成分大多無紫外吸收，且為強(qiáng)極性水溶性物質(zhì)，在常規(guī)的C18色譜柱上難以保留和檢測(cè)。此外，該指紋圖譜中只有次黃嘌呤所對(duì)應(yīng)的色譜峰為已知，其余色譜峰均為未知，無法明確是哪些成分導(dǎo)致地龍的質(zhì)量差異。綜上所述，目前現(xiàn)有方法均無法客觀準(zhǔn)確比較不同批次地龍飲片質(zhì)量均一性。

為了保證地龍飲片的質(zhì)量均一可控，需要建立一種從整體上全面表征地龍化學(xué)組成的指紋圖譜。核磁共振技術(shù)可以無損傷檢測(cè)樣本中的多數(shù)有機(jī)化合物，尤其是可以表征和檢測(cè)在液相色譜中未保留的化學(xué)成分，并且在指紋圖譜中可以反映化合物的結(jié)構(gòu)信息，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)地龍飲片的質(zhì)量均一性評(píng)價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問題本發(fā)明提供了一種地龍1H NMR指紋圖譜的構(gòu)建方法與應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：

一種地龍1H NMR指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟1，取地龍藥材粉末加入到甲醇水混合溶液中，經(jīng)渦旋，超聲提取，離心移上清旋干得到地龍?zhí)崛∥铮?/p>

步驟2，用氘代甲醇與重水的混合溶液溶解地龍?zhí)崛∥铮x心，移取上清液做核磁共振測(cè)試，譜圖導(dǎo)入核磁數(shù)據(jù)處理軟件，獲得地龍藥材1H NMR指紋圖譜；

步驟3，對(duì)地龍1H NMR圖譜進(jìn)行指認(rèn)，利用對(duì)照品結(jié)合核磁共振峰的化學(xué)位移及耦合常數(shù)分析，確定地龍指紋圖譜的特征峰。

進(jìn)一步，所述步驟1中地龍藥材粉末的用量為100～500mg；所述甲醇水混合溶液中的甲醇體積濃度為20％～60％。

進(jìn)一步，所述步驟1中甲醇水混合溶液的體積為6mL。

進(jìn)一步，所述步驟1中超聲提取時(shí)間為10～30min。