[發明專利]一種利用脂肪干細胞胞外囊泡促進皮膚損傷修復的方法

在審

• 申請號: 202010128046.7
• 申請日: 2020-02-23
• 公開（公告）號: CN111321111A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 劉凱;許鵬
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0775;C12Q1/02;A61K35/28;A61P39/06;A61P17/00
• 代理公司: 上海兆豐知識產權代理事務所(有限合伙) 31241
• 代理人: 盧艷民

本發明公開了一種利用脂肪干細胞胞外囊泡促進皮膚損傷修復的方法，包括細胞提取與鑒定步驟、脂肪干細胞胞外囊泡的提取步驟、脂肪干細胞胞外囊泡的鑒定步驟、皮膚光損傷裸鼠模型的構建和治療步驟、脂肪干細胞胞外囊泡治療皮膚光損傷的效果評估步驟、體外皮膚成纖維細胞光損傷模型建立步驟、細胞活力檢測步驟、β?半乳糖苷酶染色步驟、小鼠巨噬細胞極化誘導及治療實驗步驟、皮膚成纖維細胞內源性活性氧檢測步驟和細胞周期檢測步驟。本發明的脂肪干細胞胞外囊泡促進皮膚損傷修復的方法，揭示了脂肪干細胞來源的細胞外囊泡預防皮膚成纖維細胞光損傷的機制，并且驗證了其在動物體內的治療效應。

技術領域

本發明涉及一種利用脂肪干細胞胞外囊泡促進皮膚損傷修復的方法。

背景技術

隨著經濟社會的發展，皮膚抗衰老越來越受到大眾的關注。皮膚的衰老不僅表現在容貌上的老態，也會導致一系列的病態，如：皮膚干燥、皮膚屏障功能下降、皮膚腫瘤的發生等。因此，如何能有效的預防皮膚衰老已經成為整形修復科醫生和皮膚科醫生關注的熱點問題。從病因上講，皮膚衰老由內源性(遺傳)因素和外源性(環境)因素決定。內源性衰老即為自然性衰老，是與年齡直接相關的退行性變化，而外源性衰老是機體皮膚受到暴露因素作用后的衰老，其中紫外線的照射為主要的暴露因素，其通過引起皮膚的損傷而導致衰老。

目前，針對外源性的皮膚衰老，主要是通過口服或外用藥物進行預防和治療，其機制復雜，總的來說主要是通過拮抗氧化應激、調節炎癥反應、抑制衰老相關基因和通路的表達來延緩皮膚的衰老，但其生物利用度低、部分藥物不良反應多以及部分藥物抗皮膚衰老的療效有限等問題限制了其應用。近年來，大量的研究表明干細胞的應用能夠改善皮膚的光損傷。這其中，脂肪干細胞的應用受到了廣泛的關注，主要是因為通過抽脂術可以抽取大量的脂肪組織，而脂肪組織中富含了大量的脂肪間充質干細胞(Adipose derived stemcells，ADSCs)，因此，脂肪干細胞的來源廣泛且被證明具有許多生物效應：如促進血管生產、促進膠原合成、調節炎癥反應、抑制疤痕增生及改善皮膚光損傷等。然而，脂肪干細胞的應用存在體外培養污染的風險、移植體內致瘤的風險、自體移植供區不足的問題、異體移植免疫排斥及倫理等問題，這些問題限制了其臨床應用。另外，近年來的研究表明：干細胞主要是通過其旁分泌的一些因子來發揮作用，這其中，細胞的胞外囊泡起了重要作用。

相較于細胞治療，細胞的胞外囊泡(Excellular vesicles，EVs)是無細胞組分，其應用有許多的優勢：更加穩定、便于儲存、避免了致瘤風險、異體應用無/低的免疫排斥等。之前的報道表明：應用脂肪干細胞的胞外囊泡可以預防皮膚成纖維細胞(Fibroblasts)的光損傷，但是其確切的機制以及其應用在動物體內的效果如何仍不清楚。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種利用脂肪干細胞胞外囊泡促進皮膚損傷修復的方法，通過提取脂肪干細胞的胞外囊泡來改善皮膚光損傷，進行皮膚損傷修復，揭示了脂肪干細胞來源的細胞外囊泡預防皮膚成纖維細胞光損傷的機制，并且驗證了其在動物體內的治療效應。

實現上述目的的技術方案是：一種利用脂肪干細胞胞外囊泡促進皮膚損傷修復的方法，包括以下步驟：

S1，細胞提取與鑒定步驟，包括以下工序：

(1)脂肪干細胞的提取和鑒定：用膠原酶消化法消化抽脂術后廢棄的顆粒脂肪，提取脂肪干細胞，長滿后傳代，分別通過流式細胞術和三向誘導鑒定提取的脂肪干細胞；

(2)皮膚成纖維細胞的提取：用Dispase浸泡廢棄的包皮24小時，去除表皮，用膠原酶消化法消化剩余的真皮，提取皮膚成纖維細胞，長滿后傳代，第3～5代用于體外研究胞外囊泡對皮膚成纖維細胞光老化的研究；

S2，脂肪干細胞胞外囊泡的提取步驟：第三代的脂肪干細胞長滿以后，對脂肪干細胞進行饑餓處理48小時，然后收集細胞上清，用超濾法提取脂肪干細胞胞外囊泡(Excellular vesicles，EVs)，提取好的胞外囊泡重懸在PBS中，負80度保存；