[發明專利]一種利用脂肪干細胞胞外囊泡促進皮膚損傷修復的方法

在審

• 申請號: 202010128046.7
• 申請日: 2020-02-23
• 公開（公告）號: CN111321111A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 劉凱;許鵬
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0775;C12Q1/02;A61K35/28;A61P39/06;A61P17/00
• 代理公司: 上海兆豐知識產權代理事務所(有限合伙) 31241
• 代理人: 盧艷民

1.一種利用脂肪干細胞胞外囊泡促進皮膚損傷修復的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，細胞提取與鑒定步驟，包括以下工序：

(1)脂肪干細胞的提取和鑒定：用膠原酶消化法消化抽脂術后廢棄的顆粒脂肪，提取脂肪干細胞，長滿后傳代，分別通過流式細胞術和三向誘導鑒定提取的脂肪干細胞；

(2)皮膚成纖維細胞的提?。河肈ispase浸泡廢棄的包皮24小時，去除表皮，用膠原酶消化法消化剩余的真皮，提取皮膚成纖維細胞，長滿后傳代，第3～5代用于體外研究胞外囊泡對皮膚成纖維細胞光損傷的研究；

S2，脂肪干細胞胞外囊泡的提取步驟：第三代的脂肪干細胞長滿以后，對脂肪干細胞進行饑餓處理48小時，然后收集細胞上清，用超濾法提取脂肪干細胞胞外囊泡，提取好的胞外囊泡重懸在PBS中，負80度保存；

S3，脂肪干細胞胞外囊泡的鑒定步驟：通過透射電鏡觀察胞外囊泡的形態和大小，納米顆粒追蹤分析計算胞外囊泡的平均直徑，Western Blot檢測胞外囊泡的標志物CD81、CD63、CD9及TSG101；

S4，皮膚光損傷裸鼠模型的構建和治療步驟：取5周齡大小的雌性BALB/c裸鼠40只，常規飼養在SPF環境下1周以適應環境；從第6周開始，裸鼠隨機均分成4組：

(1)對照組：不進行UVB照射，也不進行皮下注射治療；

(2)UVB組：對裸鼠進行UVB照射+皮下注射PBS；

(3)UVB+150ug/week組：對裸鼠進行UVB照射+皮下注射150ug/week的胞外囊泡；

(4)UVB+300ug/week組：對裸鼠進行UVB照射+皮下注射300ug/week的胞外囊泡；

皮膚光損傷裸鼠模型建立過程如下：在鼠籠上方架設UVB燈管，使裸鼠處在UVB的直射下并能自由活動，在UVB燈下放置能量檢測儀，第一周的照射的能量由最小紅斑量確定，每周照射5天，后續每周增加一個最小紅斑量的照射劑量，一共照射8周；

S5，脂肪干細胞胞外囊泡治療光老化的效果評估步驟，包括以下工序：

(1)對每組裸鼠的注射部位進行皮膚多功能成像儀檢測大體皺紋情況，通過偏振光模式反應皮膚的厚度，3D粗糙度評估皮膚粗糙程度，并綜合進行評分；

(2)對每組裸鼠的注射部位取材，分別進行HE染色和馬松染色，計算表皮厚度和真皮厚度并統計，進行PCNA和CD68染色了解皮膚中細胞的增殖情況和巨噬細胞浸潤情況；

S6，體外皮膚成纖維細胞光損傷模型建立步驟：將皮膚成纖維細胞接種在96孔板或者6孔板，根據分組加入/不加入不同濃度的胞外囊泡，培養24小時后，去除細胞上清液，用PBS清洗兩遍，用一薄層PBS覆蓋細胞，然后將紫外線燈架在細胞之上，調節紫外線燈的能量密度為100mJ/cm²，照射之后，去除覆蓋的PBS，更換新鮮的培養液，繼續培養并進行后續實驗；

S7，細胞活力檢測步驟：皮膚成纖維細胞接種在96孔板中，根據分組加入/不加入不同濃度的胞外囊泡，紫外線光照細胞，光照好以后，更換新鮮培養液繼續培養72小時，用CCK-8試劑盒按照說明書步驟測量450nm下細胞OD值，細胞活力通過如下公式計算：

細胞活力＝(治療組細胞OD值/對照組OD值)×100％

通過不光照細胞和光照細胞兩個維度確定后續細胞實驗所用胞外囊泡的濃度；

S8，β-半乳糖苷酶染色步驟：皮膚成纖維細胞接種在6孔板中，光照細胞后72小時，用β-半乳糖苷酶試劑盒按照說明書步驟對各組細胞進行染色，染色結束后，在倒置顯微鏡下觀察細胞并拍照，每個孔隨機拍5個視野，并計算平均染色陽性細胞數，計算公式如下：

陽性率＝(染色陽性細胞數/總細胞數)×100％；

S9，小鼠巨噬細胞極化誘導及治療實驗步驟：為了研究胞外囊泡調節巨噬細胞的作用，將5×10⁵/孔raw 264.7細胞系接種在6孔板中，細胞貼壁以后，去除培養液，分別加入普通培養體系培養液、培養液+1mg/mL LPS+20ng/mL IFN-γ、培養液+1mg/mLLPS+20ng/mLIFN-γ+不同濃度的胞外囊泡，孵育24小時后，分別用流式細胞術、實時定量基因擴增熒光檢測(Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR)、Western Blot檢測巨噬細胞極化情況；

S10，皮膚成纖維細胞內源性活性氧檢測步驟：將皮膚成纖維細胞接種在6孔板中，與不同濃度的胞外囊泡孵育24小時，去除培養液，按照試劑盒說明書將熒光試劑DCFH2-DA(10μM)與細胞在37℃孵育20分鐘，去除試劑，然后用無血清的DMEM清洗3遍，消化下細胞進行流式分析，計算平均熒光強度，未消化的細胞在熒光顯微鏡下觀察并拍照；

S11，細胞周期檢測步驟：將皮膚成纖維細胞接種在6孔板中，與不同濃度的胞外囊泡孵育24小時，然后對細胞進行紫外線照射，照射后24小時用細胞周期試劑盒按照說明書進行檢測。