[發(fā)明專利]一種新型冠狀病毒抗原膠體金快速診斷試劑盒及其制備方法

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• 申請日: 2020-02-27
• 公開（公告）號: CN111337668A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊正林;石毅;蔣黎;鐘凌;串俊蘭;龔波;徐雨;干盈盈;龍騰鑲
• 申請（專利權(quán)）人: 四川省人民醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 成都行之專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51220
• 代理人: 梁田

1.一種新型冠狀病毒抗原膠體金快速診斷試劑盒，其特征在于，包括SARS-CoV-2核衣殼蛋白抗原膠體金。

2.如權(quán)利要求1所述的一種新型冠狀病毒抗原膠體金快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將SARS-CoV-2核衣殼蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化；

(2)制備SARS-CoV-2核衣殼蛋白抗原膠體金。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種新型冠狀病毒抗原膠體金快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，SARS-CoV-2核衣殼蛋白的表達(dá)，包括如下步驟：

(11)以SARS-CoV-2核衣殼蛋白的氨基酸序列所對應(yīng)的核苷酸序列為模板，設(shè)計核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5所示的反向引物；

(12)經(jīng)過PCR擴(kuò)增、雙酶切PCR產(chǎn)物及載體，將SARS-CoV-2核衣殼蛋白對應(yīng)的核苷酸序列克隆至質(zhì)粒載體中；

(13)利用步驟(12)所得載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；

(14)對培養(yǎng)后的大腸桿菌進(jìn)行離心，獲取SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種新型冠狀病毒抗原膠體金快速診斷試劑盒的制備方法，步驟(12)中，所述質(zhì)粒載體為pET28a、pET22b、pET21b、pET32a、pET40、pGex-6P-1和pMal-c2x中的任意一種。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種新型冠狀病毒抗原膠體金快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟(13)中，大腸桿菌采用E.coli BL21或者Rossetta菌株，誘導(dǎo)培養(yǎng)方法為：將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含有氨芐青霉素或卡那霉素的平板中，于37℃孵育，然后挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-5h，最后加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)3-18h。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種新型冠狀病毒抗原膠體金快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟(14)中，SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白的獲取方法為：收集離心后的大腸桿菌菌體，加入緩沖液破碎菌體后離心獲取上清液，經(jīng)過層析進(jìn)行純化，獲得SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種新型冠狀病毒抗原膠體金快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，SARS-CoV-2核衣殼蛋白純化后，利用抗N蛋白的抗體進(jìn)行驗證。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種新型冠狀病毒抗原膠體金快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，制備SARS-CoV-2核衣殼蛋白抗原膠體金的具體步驟如下：

(21)以氯金酸溶液、檸檬酸三鈉水溶液為原料配制膠體金溶液；

(22)將SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白溶液轉(zhuǎn)入透析袋中，透析過夜；

(23)將透析處理之后的SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白加入等體積的膠體金溶液中，靜置，然后加入BSA溶液，充分混勻后離心，棄上清液，膠體金沉淀用保護(hù)液再溶解，即制得SARS-CoV-2核衣殼蛋白抗原膠體金。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種新型冠狀病毒抗原膠體金快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟(22)中，透析方法為：將SARS-CoV-2核衣殼蛋白溶液濃度稀釋至1mg/mL后轉(zhuǎn)入透析袋中，2-8℃下用濃度為20mmol/L、pH值為7.0的Tris緩沖液透析過夜。